猪圆环病毒2型ORF2-ORF1串联基因的原核表达及活性分析

为探讨原核表达的PCV-2ORF2-ORF1串联蛋白的抗原性及其作为基因工程亚单位疫苗的可能性,以构建好的PCV-2大庆分离株质粒pMD-18T/PCV-2为模板,PCR分别扩增去掉核定位信号的Cap蛋白基因(dNLS-ORF2)和Rep蛋白基因(ORF1),将其串联克隆到原核表达载体pET30a(+)上,经PCR、酶切和测序鉴定,成功构建了重组质粒pET30a-ORF2/ORF1。转化E.coli BL21(DE3)pLysS感受态细胞,经IPTG诱导后,进行SDS-PAGE电泳与Western blot分析。纯化的重组蛋白与PCV-2阳性血清发生特异性反应,并能与免疫小鼠的抗血清发生特异性反应。重组蛋白具有较好的免疫学活性,为基因工程亚单位疫苗的研制奠定了基础。

猪戊型肝炎病毒ORF2主要抗原表位区间接ELISA方法的初步建立

应用原核表达系统表达猪戊型肝炎病毒ORF2蛋白C端和N端的主要抗原表位区,重组蛋白命名为ORF2-C和ORF2-N,初步建立间接ELISA诊断方法。用重组蛋白ORF2-C和ORF2-N作为诊断抗原,对反应条件进行优化,初步建立ELISA诊断方法。抗原最适包被浓度ORF2-C为8μg/mL、ORF2-N为12μg/mL;血清最适稀释度均为1∶50,ORF2-C作用时间为50min、ORF2-N作用时间为90min;酶标抗体最适稀释度为1∶5000;ORF2-C判定标准:D450nm值≥0.348为阳性,D450nm值<0.348为阴性;ORF2-N判定标准:D450nm值≥0.397为阳性,D450nm值<0.397为阴性。与戊型肝炎病毒诊断试剂盒检测结果相比,阳性符合率分别为93.3%、86.7%。利用重组蛋白建立的ELISA方法特异性、敏感性和重复性均较好,且ORF2-C的检测效率明显高于ORF2-N,该方法的初步建立为进一步完善猪戊型肝炎病毒诊断方法奠定基础。

猪圆环病毒2型ORF3基因的原核表达

用原核表达系统表达猪圆环病毒2型ORF3基因,分析ORF3蛋白的抗原性。根据GenBank上公布的猪圆环病毒2型(PCV-2)核苷酸序列进行分析,针对ORF3基因设计并合成1对特异性引物,PCR扩增该基因,并将此片段克隆入原核表达载体pET-32a(+)上,命名为pET32a-ORF3,转化大肠杆菌Rosetta-blue(DE3)pLacⅠ感受态细胞,1.0mmol/L IPTG37℃诱导表达。结果表明,PCR扩增得到315bp的片段,重组蛋白大小约为29ku,与预期大小相符。Western blotting分析结果表明,重组蛋白能与抗His-tag的单克隆抗体反应,不与PCV-2阳性血清发生反应。猪圆环病毒2型ORF3基因能在大肠杆菌中成功表达,但与阳性血清之间没有反应原性,为进一步研究PCV-2ORF3蛋白的功能及特性奠定基础。

猪戊型肝炎病毒ORF2蛋白N端主要抗原表位区的原核表达

用原核表达系统表达猪戊型肝炎病毒ORF2蛋白N端的主要抗原表位区。通过对GenBank公布的猪戊型肝炎病毒DQ1株ORF2的氨基酸序列进行分析,确定了其N端抗原性较高的区域,针对此区域设计并合成了1对特异性引物,RT-PCR扩增该区段,并将此片段克隆到原核表达载体pET30a(+)上,命名为pET30a-ORF2N,转化大肠杆菌BL21感受态细胞,1.0 mmol/LIPTG37℃诱导表达。RT-PCR扩增得到424 bp的片段,重组蛋白大小约为21.8 ku,与预期大小相符。West-ern blotting分析结果表明,该蛋白能与阳性血清发生特异性反应,证明该蛋白具有生物学活性。猪戊型肝炎病毒ORF2蛋白N端主要抗原表位区在大肠杆菌中成功表达,具有一定的反应原性,为进一步用其建立诊断方法奠定基础。

猪戊型肝炎病毒ORF2蛋白C端主要抗原表位区的原核表达

利用分子生物学软件分析GenBank公布的猪戊型肝炎病毒DQ1株ORF2的氨基酸序列,确定了其C端抗原性较高的区域,针对此区域设计并合成了一对特异性引物,RT-PCR扩增该区域,并将此片段克隆到原核表达载体pET30a(+)上,命名为pET30a-ORF2C,然后转化大肠埃希菌BL21感受态细胞,1.0 mmol/L IPTG 37℃诱导表达。结果表明,RT-PCR扩增得到301 bp的片段,重组蛋白大小约为18 ku,与预期大小相符。Western blot分析表明,该蛋白与阳性血清发生特异性反应,为进一步利用其建立诊断方法奠定了基础。

牛副流感病毒3型N基因的克隆与系统进化分析

扩增大庆地区分离的牛副流感病毒3型的N基因,并进行同源性分析。设计特异性引物,通过聚合酶链反应扩增牛副流感3型N基因,将该基因分别连接到克隆载体的BamHⅠ、HindⅢ酶切位点中,测定插入片段的核苷酸序列,并利用分子生物学软件进行同源性分析。序列分析结果表明,扩增获得BPIV-3-N基因全长1 548bp,编码515个氨基酸,该N段基因核苷酸序列及所推导的氨基酸序列与GenBank中日本分离株910N基因序列同源性较高,核苷酸同源性为99.7%,氨基酸同源性为100%。

CpG ODN、氢氧化铝和大肠埃希菌不耐热肠毒素无毒突变体联合佐剂对猪轮状病毒△VP8亚蛋白免疫效果的影响

目的评价Cp G ODN、氢氧化铝[Al(OH)3]和大肠埃希菌不耐热肠毒素(heat-labile enterotoxin,LT)无毒突变体联合佐剂对猪轮状病毒(porcine rotavirus,PRV)△VP8*亚蛋白免疫效果的影响。方法将LT A亚基上63位丝氨酸突变为赖氨酸,构建LT的无毒突变体重组表达质粒p ET-30a(+)-LTK63,于E.coli表达重组蛋白LTK63,并进行纯化。将小鼠随机分为LTK63+Al(OH)3组、Cp G ODN+Al(OH)3组、Cp G ODN+LTK63+Al(OH)3组及Al(OH)3对照组,将P2-SB-1AΔVP8*抗原蛋白分别与各组相应佐剂共同免疫小鼠,均经颈部皮下注射,隔2周免疫1次,共3次,于每次免疫后14 d采血,分离血清,间接ELISA法检测血清抗体效价及Ig G亚型;末次免疫2周后,MTT法检测小鼠特异性淋巴细胞的增殖。结果经双酶切及测序鉴定,重组质粒p ET-30a(+)-LTK63构建正确;表达和纯化产物经SDS-PAGE及Western blot分析,均可见相对分子质量约33 000(A亚基)和13 000(B亚基)的目的蛋白条带。二免后,Cp G ODN+LTK63+Al(OH)3组的抗体滴度显著高于LTK63+Al(OH)3组、Cp G ODN+Al(OH)3组和Al(OH)3对照组(P<0.05);末次免疫后2周,Cp G ODN+Al(OH)3组抗体滴度显著高于Al(OH)3对照组、Cp G ODN+LTK63+Al(OH)3组和LTK63+Al(OH)3组(P<0.001);Cp G ODN+LTK63+Al(OH)3和LTK63+Al(OH)3组小鼠血清中Ig G2a和Ig G1水平相当,Cp G ODN+Al(OH)3组血清抗体以Ig G2a为主,Al(OH)3对照组血清Ig G以Ig G1为主;Cp G ODN+Al(OH)3组小鼠特异性淋巴细胞的增殖能力最强。结论 Cp G ODN+Al(OH)3联合佐剂表现出明显的协同效应,可显著提高小鼠对PRV△VP8*亚蛋白的体液免疫和细胞免疫应答。

牛UK株轮状病毒VP8蛋白多拷贝嵌合表位的免疫原性分析

轮状病毒VP8＊蛋白由纤突蛋白VP4裂解形成,VP8＊蛋白决定了VP4蛋白血清特异性中和反应相关,本试验原核表达UK株牛轮状病毒VP8＊多拷贝嵌合肽段,纯化并比较分析其免疫原性。首先根据GenBank上发表的牛轮状病毒UK株VP8＊蛋白的编码序列及可能的主要抗原表位区（aa 1~11和aa 218~235）,设计并合成引物,以扩增这两个区段的嵌合基因,克隆到原核表达载体pET-28α（＋）上,并通过酶切位点连接构建嵌合基因的3拷贝重复重组表达载体,同时构建单拷贝和全长VP8＊表达载体。重组载体转化到E.coli感受态细胞中,IPTG诱导表达后,重组蛋白经SDS-PAGE和Western blot证实重组蛋白大小与预期相符且能与His-tag单抗发生特异性反应;ELISA结果表明免疫后3拷贝蛋白较单拷贝蛋白血清抗体水平更高。本试验确定了原核表达的3拷贝嵌合VP8＊重组蛋白免疫后具有良好的抗原性,为今后抗轮状病毒疫苗的研制及抗轮状病毒药物的发展提供参考。

破伤风毒素T细胞表位P2对猪轮状病毒△VP8^＊蛋白免疫原性的增强作用

仔猪轮状病毒腹泻严重危害养猪业，为了开发亚单位疫苗，本课题组前期构建了猪轮状病毒SB-1A株截短的VP8^＊蛋白（△VP8^＊，64～223位氨基酸）原核表达载体pET28a—SB1A△VP8^＊。为了进一步提高亚单位疫苗的免疫原性，将破伤风毒素的通用T细胞表位P2引入重组亚单位蛋白，构建重组载体pET28a—P2-SB-IA△VP8^＊。P2-S13-1A△VP8^＊和S13-1A△VP8^＊在大肠杆菌中表达并纯化。重组蛋白与氢氧化铝佐剂混合后经肌肉注射免疫Balb／c小鼠，利用间接ELISA法检测免疫小鼠的血清抗体水平。结果显示：P2-S13-1A△VP8^＊和S昏1A△VP8^＊在大肠杆菌中得到了高水平、可溶性表达；重组蛋白P2-SB-1A△VP8^＊诱导的血清抗体水平显著高于SB-1A△VP8^＊，说明P2可以增强SB-1A△VP8^＊的免疫原性，为日后开发猪轮状病毒亚单位疫苗奠定了基础。

牛副流感病毒3型血凝素-神经氨酸酶蛋白在杆状病毒中的表达

目的在杆状病毒中表达牛副流感病毒3型(bovine parainfluenza virus type-3,BPIV-3)血凝素-神经氨酸酶蛋白(hemagglutinin-neuraminidase,HN)。方法提取BPIV-3 BN-1株RNA,设计特异性引物扩增HN全长ORF,将其克隆至杆状病毒供体载体p Fast Bac HTA中,获得重组供体质粒p Fast Bac-HN。将p Fast Bac-HN转化至感受态细胞E.coli DH10Bac,制备穿梭质粒Bacmid-HN。将纯化的Bacmid-HN经脂质体转染至Sf21昆虫细胞,拯救重组杆状病毒,并进行Western blot鉴定。结果经PCR及测序鉴定证明,HN基因重组供体质粒p Fast Bac-HN及穿梭质粒Bacmid-HN构建正确。利用Sf21昆虫细胞成功拯救重组杆状病毒,连续传代扩增3代的病毒滴度为2×108 CPE/ml。重组HN蛋白的相对分子质量约70 000,可与BPIV-3阳性血清发生特异性反应。结论在杆状病毒表达系统中成功表达了BPIV-3重组HN蛋白,为BPIV-3的诊断及疫苗效力评价奠定了基础。