2株青贮玉米根际固氮菌的筛选鉴定及促生作用研究

为了获得优良的固氮菌,并评价其对青贮玉米的促生效果,本研究采用稀释涂布平板法,利用阿须贝氏固体培养基从青贮玉米根际土壤中分离筛选到10株固氮菌,对其固氮能力进行分析,结果表明,菌株ZL-2和ZL^(-1)3的固氮能力较强,菌株ZL-2的固氮量为1.07μg·mL^(-1),ZL^(-1)3的固氮量为0.95μg·mL^(-1)。通过细菌形态学、16S rDNA序列分析和生理生化特征,确定菌株ZL-2为生癌肠杆菌和ZL^(-1)3为成团泛菌。对2株固氮菌的促生特性进行分析,结果表明,2个菌株具有泌铵能力、溶磷能力、产嗜铁素能力和合成吲哚-3-乙酸(IAA)的能力。盆栽试验结果表明,接种固氮菌ZL-2和ZL^(-1)3能够显著提高青贮玉米的株高、根长、地上和地下干、鲜重(P<0.05)。田间试验结果表明,2株固氮菌单接种和双接种均能提高青贮玉米的株高、茎粗、产量、粗蛋白含量和全磷含量(P<0.05)。接种2株固氮菌的青贮玉米,其氮代谢和氨同化相关基因(ZmAMT-4、ZmAMTB、ZmGOGAT2和ZmGS1-3)的表达量显著提高(P<0.05)。因此,2株固氮菌具有较好的促生特性,在提高青贮玉米的产量和品质方面发挥了重要作用,是开发微生物菌剂的优质菌种资源。

一株木质素降解细菌的分离、鉴定与降解条件优化

高效降解和转化木质素的微生物资源对于秸秆类生物质资源化利用至关重要。通过梯度稀释和苯胺蓝脱色法从木质素降解复合菌系中筛选出木质素降解细菌,经16S rRNA和生理生化试验将菌株归类为Pseudomonas guguanensis。采用单因素、Plackett-Burman和响应面分析的方法确定菌株最佳培养条件。单因素试验表明:木质素添加量、装液量、pH为显著影响因子;响应面试验确定最佳培养条件:装液量为28mL·100 mL^(-1)、木质素添加量为0.6g·L^(-1) pH为7.4。在此条件下,木质素降解率为29.1%,比优化前提高了16.4%,研究丰富了降解木质素的微生物资源。

秸秆降解微生物菌组的构建及降解条件优化

秸秆因结构致密降解较难的问题长期影响其高效利用,本文对有效降解纤维素的微生物菌组进行研究。从黑龙江省、内蒙古自治区等地的秸秆发酵堆、沼渣、青贮饲料、牛粪、树木腐殖质等存在降解纤维素菌株的生境中采集样本146份;采用刚果红染色和滤纸摇瓶筛选等方法分离出纤维素降解菌20株,再通过多菌拮抗试验与多菌同促酶活检测结合的双向选择法,筛选出6株菌株构建同促酶活最高的共生菌组,经16S rDNA分子生物学初步鉴定,该菌组由6株芽孢杆菌组成。经发酵验证,接种构建菌组于纤维素降解培养基发酵后,各组分降解率都有明显提高。以降解率作为评价指标,采用单因素试验及响应面分析对发酵降解条件进行优化,在接种量为5%条件下得到最优发酵条件为:温度37℃、pH6.5、发酵时间8d,此时秸秆粉失重率达52.85±0.25%。各纤维成分及扫描电镜结果变化均表明构建的菌组对木质纤维素具有较强的降解能力。

耐盐解磷菌筛选鉴定及生理特性研究

磷是植物生长所必需营养元素,但磷元素利用效率较低,在盐碱土中表现更为突出。施用耐盐解磷微生物是提高盐碱地中磷利用率的有效方式。从黑龙江省齐齐哈尔市盐碱土壤中筛选耐盐碱解磷细菌,利用蒙金娜(PVK)培养基和溶菌肉汤(LB)培养基稀释涂布法,经多次分离纯化获得53株细菌,结合化学测定,最终获得一株解磷能力较强菌株P-W13,经透射电镜和分子生物学鉴定确定解磷细菌P-W13为肠杆菌属(Enterobacter sp.)。该菌株在培养144 h时解磷能力最强,为89.86 mg·L^(-1);该菌株可产生富马酸、丁二酸和丙酸,其中丙酸含量最高,其解磷能力与发酵液pH及菌株生长量之间存在极显著相关性,菌株P-W13在10%NaCl盐分浓度和pH为10时仍表现较强解磷能力;菌株P-W13产生吲哚乙酸(IAA)和胞外多糖含量分别为42.10和72.55 mg·L^(-1);此外,菌株PW13发酵液处理的种子发芽率、芽长、根长相比对照分别提高5.68%、68.35%、94.10%。研究筛选得到的肠杆菌属P-W13菌株具有较强解磷能力、耐盐碱性和植物促生作用,研究为盐碱地改良提供微生物菌种资源。

耐热解淀粉芽孢杆菌BA-DES4产纤维素酶的分离纯化及酶学性质

目的:本研究以一株产纤维素酶的解淀粉芽孢杆菌BA-DES4为材料,纯化并研究了其纤维素酶的酶学性质。方法:研究采用硫酸铵分级沉淀及SephadexG-75凝胶过滤层析方式对其所产纤维素酶进行分离纯化,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)确定其分子量,并对纯化后纤维素酶的酶液进行酶学性质研究。结果表明:发酵液中分离纯化获得纤维素酶系组分(内切葡聚糖酶),对纯化的电泳内切葡聚糖酶进行酶活测定,其比活力为51.08 U/mg。发现其分子量为22.4 kDa;初步酶学性质研究表明:该酶的最适反应温度和最适pH分别为65℃和6.0,且在pH5.0~7.0和温度55~65℃下稳定性较高;Mn^(2+)对纤维素酶活力激活作用较为显著,Cu^(2+)的抑制作用最大。结论:该菌株可作为产内切葡聚糖酶的潜在菌株,内切葡聚糖酶可在Mn^(2+)、Fe^(2+)的作用下促进酶活力,同时在高温及酸性环境中发挥作用,能够参与高效降解高温酸性环境中的纤维素,提高生产率,同时将分解成的葡萄糖供发酵使用,具有应用高温大曲发酵酒生产的潜力,为该酶的进一步研究奠定了基础。

不同复合微生物菌剂及施用量对番茄生长和品质的影响

【目的】探究不同复合微生物菌剂对番茄生长及果实品质的影响,筛选最佳菌剂及其施用量,为番茄优质高效生产提供参考。【方法】以‘巴德丽1号’为供试番茄品种,采用盆栽试验,选用4种复合微生物菌剂(J1、J2、J3、J4),设3种施用量水平,分别为1×10^(3),1×10^(5),1×107CFU/株,记为T1、T2、T3,进行完全组合试验设计,共计12个处理,分别为J1T1、J1T2、J1T3、J2T1、J2T2、J2T3、J3T1、J3T2、J3T3、J4T1、J4T2、J4T3。以喷施清水为对照(CK),测定不同处理番茄生长指标、生理指标以及果实品质。【结果】7月14日,不同复合微生物菌剂处理番茄株高、茎粗均高于CK,其中J4T2处理番茄植株株高和茎粗均最大。随着时间的延长,各处理叶片的叶绿素含量均呈先增加后减小趋势,其中7月3日各处理叶绿素含量均达到峰值,此时J4T2处理叶片的叶绿素含量最高。与CK相比,喷施J1、J2、J3、J4菌剂均能提高番茄根系活力,但只有喷施J4菌剂处理与CK之间有显著差异。7月3日至7月14日,与CK相比,喷施J1、J2、J3、J4菌剂均降低了叶片MDA含量,其中喷施J4菌剂处理的降低幅度最大。随着番茄植株的生长,各处理叶片中SOD活性均呈现先升高后降低的趋势,且各处理SOD活性均于7月3日达到峰值,此时喷施复合微生物菌剂处理的SOD活性均显著高于CK,其中以处理J4T2的SOD活性最高;随着番茄植株的不断生长,叶片中的POD活性不断升高,其中J3、J4菌剂对POD活性影响较大。与CK相比,4种复合微生物菌剂处理番茄果实中的可溶性蛋白、维生素C、可溶性糖与番茄红素含量均显著提高,其中J4T2处理的以上指标均为最高;4种复合微生物菌剂处理番茄果实中的有机酸含量均显著降低,其中以J4T2处理最低。【结论】添加适量的复合微生物菌剂可有效促进番茄植株生长,提高根系活力与叶绿素含量,改善保护酶活性与果实营养品质,其中J4T2处理的效果最佳。

内源乳化法制备青春双歧杆菌微胶囊

为提高青春双歧杆菌存活率及抵抗不利环境的能力,以青春双歧杆菌为研究对象,采用海藻酸钠与乳清蛋白为复合壁材,通过内源乳化法制备微胶囊,并对其进行模拟人工胃肠试验和贮藏稳定性试验。以包埋率为考察指标,根据单因素试验探究海藻酸钠添加量、水相油相体积比、吐温80添加量、搅拌速度和乳化时间等因素对包埋率的影响。采用响应面分析法对海藻酸钠添加量、吐温80添加量、搅拌速度进行分析和优化。结果表明:制备青春双歧杆菌微胶囊的最佳工艺条件为海藻酸钠添加量2%(m/m),吐温80添加量0.6mL,搅拌速度430 r/min,包埋率为83.05%。青春双歧杆菌微胶囊于模拟人工胃、肠液中放置180 min,菌体存活率分别为59.89%、66.45%;于4℃环境下贮藏42d,存活率为56.83%。研究表明:以内源乳化法制得的青春双歧杆菌微胶囊对模拟胃肠液环境具有良好的耐酸性及肠溶性,在4℃环境中具有良好的贮藏稳定性。

2株紫花苜蓿解钾菌的筛选鉴定及其对产量和品质的影响

为获得优良的解钾菌(KSB)并明确其对植物产量和品质的影响,采用硅酸盐细菌培养基从紫花苜蓿根际土壤分离、筛选到2株具有高效解钾能力的菌株。通过细菌形态学、16S rDNA序列分析和生理生化鉴定,确定2株解钾菌分别为巨大芽孢杆菌和耐寒短杆菌,命名为XLT-4和XLT-7。2株菌株均具有产吲哚-3-乙酸(IAA)、铁载体和溶磷能力。接种XLT-4和XLT-7显著提高了紫花苜蓿的株高、根长、地上和地下干鲜重,以及根系活力、叶片的磷、钾和粗蛋白含量,降低了中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维的含量。此外,接种2株解钾菌还提高了紫花苜蓿根际土壤酶活性和速效钾含量。本研究获得的2株解钾菌在提高紫花苜蓿产量和品质方面发挥了重要作用,是开发微生物制剂的优质菌株资源。

利用沼渣栽培黑木耳

为探讨沼渣栽培黑木耳(Auricularia heimuer)的可行性,比较分析了沼渣、杂木屑、秸秆的物理性质、营养成分、重金属含量,通过在PDA培养基中分别添加质量分数为0、1.25%、2.50%和5.00%的沼渣培养菌丝体,测定菌丝生长速度;再以不添加沼渣的配方为对照组,分别以添加8%、16%、24%、32%沼渣替代杂木屑为实验组栽培黑木耳,计算菌丝生长速度和出芽率,统计单袋产量,采用感观评价法评价子实体质量,并测定子实体中Pb、Cd、Hg、As的含量。结果表明:沼渣和杂木屑的粒径大小和总孔隙度大致相同,但是在pH、电导率、含水量、容重、大孔隙度、小孔隙度和吸水力方面,二者之间的差异具有统计学意义(P<0.05);沼渣中重金属含量较高,其中Pb含量分别为杂木屑和秸秆的3.39倍和1.60倍,但是重金属含量均未超过标准要求;在PDA培养基中添加沼渣后黑木耳的菌丝生长速度均比对照组快,添加2.50%沼渣后菌丝生长速度最快,为(0.55±0.02)cm·d^-1;培养料中添加8%和16%沼渣的配方的黑木耳出芽率、单袋产量和感官评价得分与对照组相比组间差异没有统计学意义,可用于栽培黑木耳。因此,利用沼渣部分替代杂木屑栽培黑木耳是可行的。

响应面法优化发酵蔗渣制备膳食纤维工艺及结构特性分析

本研究以甘蔗渣作为原料,采用枯草芽孢杆菌发酵法制备蔗渣膳食纤维,通过单因素实验及响应面试验优化可溶性膳食纤维(soluble dietary fiber,SDF)制备工艺,并对发酵前和发酵后膳食纤维的理化性质、结构及体外抗氧化活性进行了对比研究。结果表明,最佳制备工艺为接种量10%、pH为7、发酵时间71 h,此条件下可溶性膳食纤维提取率为17.95%±0.06%。理化性质的研究表明,发酵后的膳食纤维较发酵前样品持水力、持油力及膨胀力都有所增大且结果差异显著(P<0.05);观察其超微结构发现,经过发酵处理后膳食纤维粒径变小,呈现片层状态;红外图谱表明发酵后膳食纤维吸收峰强度增大,整体峰型及位置未发生改变;X-射线衍射图谱表明发酵处理后衍射峰强度减弱,结晶结构未发生变化。发酵后的膳食纤维DPPH自由基清除能率、还原力、羟自由基清除率相较于未发酵原料(dietary fiber,DF)最高分别提高了32.9%、0.70、50.55%(P<0.05)。发酵法制备蔗渣膳食纤维可以改善其理化性质及结构,有效提高其抗氧化性。本实验为有效利用甘蔗原料,为副产物的加工利用以及避免资源浪费提供了理论依据。

绿色木霉内切葡聚糖酶基因Eg Ⅶ的克隆及其表达

【目的】在枯草芽孢杆菌中表达绿色木霉(Trichodoma vivide,T.viride)内切葡聚糖酶基因EgⅦ。研究内切葡聚糖酶基因EgⅦ的生物信息、基因克隆与表达及重组酶学性质。【方法】提取纤维素酶生产菌株绿色木霉AS3.3711的总RNA,通过反转录合成cDNA,并以之为模板利用PCR技术扩增获得内切葡聚糖酶基因EgⅦ,并进行生物信息学分析;构建了重组表达载体pMA5-EgⅦ,并利用热激转化法将其转入枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis,B.subtilis)WB600感受态细胞中,成功进行表达。【结果】生物信息学分析表明,内切葡聚糖酶基因EgⅦ编码249个氨基酸,蛋白质的分子量为26.8002 KD,理论等电点7.62,属于胞外蛋白;预测蛋白质三级结构与二级结构一致,由ɑ-螺旋、延伸链区、β-转角和无规则卷曲构成。电泳结果表示,重组枯草芽孢杆菌在EgⅦ基因片段大小符合处出现条带,表明成功将EgⅦ-pMA5转化到B.subtilis WB600中。刚果红染色结果显示重组枯草芽孢杆菌在CMC培养基上出现较大直径的透明圈,重组菌株上清粗酶液DNS酶活力达到22.71 U/mL,表明绿色木霉内切葡聚糖酶基因EgⅦ可以在枯草芽孢杆菌中表达,并具有较高活性。重组酶酶学性质分析表明,该酶的最适温度是60℃,最适pH值为6.4,且温度在50℃以下,pH值在5.6~8.0范围内,酶活力具有良好的稳定性。【结论】通过对内切葡聚糖酶基因EgⅦ克隆及分析,获得了表达内切葡聚糖酶基因EgⅦ的枯草芽孢杆菌基因工程菌,了解了重组酶酶学性质,为纤维素酶的广泛应用提供了理论基础。