氮胁迫对甜菜幼苗生理以及相关NRTs基因表达的影响

为了深入研究缺氮环境下甜菜(Beta vulgaris L.)的氮利用调控机制,并为利用分子育种以及基因工程途径提高植物的氮利用率奠定基础,本研究以甜菜幼苗‘780016B/12优’为试材,通过对其施加低氮和缺氮逆境胁迫,利用表型观察、叶绿素含量的测定以及相关基因和酶活性的应答变化分析,来研究甜菜植株在生理以及分子方面的应答机制。研究结果表明,甜菜叶片由于缺氮而表现出局部变黄,并且SPAD值显示,叶绿素含量随逆境时间呈下降趋势。qPCR表明,BvNRT2.1和BvNRT3.2基因均受到低氮和缺氮胁迫的诱导,且它们在根部的表达量要高于叶中,BvNRT2.1基因对逆境的应答更为显著。同时,随着胁迫时间的增长,甜菜体内的硝酸还原酶活性逐渐下降,但叶片中该酶的活性始终要高于根中。因此可以得出结论,低氮或缺氮逆境对甜菜幼苗的光合作用、硝酸还原酶活性造成了较为严重的影响,从而导致其生长在一定程度上受到抑制。可以推断,为了适应氮胁迫环境,甜菜自身可能通过上调硝酸盐转运蛋白基因的表达等途径来直接或间接的补偿由于环境氮缺乏或低氮造成的营养缺失,以抵御逆境伤害。

能源甜菜BvHIPP24基因的特性及在酵母中的镉耐受功能分析

为了进一步研究重金属相关异戊二烯化植物蛋白在重金属逆境下的解毒机制,本研究克隆了能源甜菜BvHIPP24基因并分析了其在镉逆境下酵母中的功能。本研究以能源甜菜为实验材料,利用RTPCR的方法克隆获得能源甜菜BvHIPP24基因,并对BvHIPP24基因进行生物信息学分析;利用酵母表达载体构建pYES2-BvHIPP24重组质粒并转化到酵母InVSc1,在真核酵母细胞中进行BvHIPP24基因应答镉胁迫的研究。生物信息学分析显示BvHIPP24基因的CDS全长444 bp,编码147个氨基酸,氨基酸序列的分子量为16377.34 Da,理论等电点为9.39,为亲水蛋白,不含有跨膜区域,定位于叶绿体。保守结构域分析该基因具有一个HMA结构域。构建进化树分析表明,能源甜菜BvHIPP24蛋白与BvHIPP23蛋白质具有较近的亲缘关系。当施加0.5 mmol/L CdCl_(2)胁迫后,适量表达BvHIPP24的重组菌与对照菌株相比,其生长趋势明显优于后者,并发挥着相对更高的Cd耐受性。这说明,能源甜菜BvHIPP24基因在镉逆境胁迫下发挥着重要的解毒作用,并有可能直接或间接参与细胞重金属离子吸收、转运及代谢平衡等过程。

甜菜幼苗对干旱胁迫的适应机制

为了研究甜菜幼苗在干旱逆境耐受过程中的应答机制,本研究以‘780016B/12优’为目的材料,通过设置不同浓度(3%、6%,9%以及15%)的PEG6000干旱胁迫来处理甜菜幼苗,并进行恢复生长,来衡量不同干旱胁迫处理间甜菜的相关生理生化指标和目的基因的表达量变化。研究结果表明,逆境胁迫24 h后,随着干旱强度的增加,甜菜幼苗植株的皱缩和萎蔫程度也逐渐严重,并伴随着叶片相对含水量(3.48%~15.86%)以及叶绿素含量(5.60~13.06)的下降;而体内的丙二醛和脯氨酸却大量累积,其中以15%PEG增加的尤为明显,分别高达48.23μmol/L和201.37μmol/L左右。逆境恢复后,3%PEG处理的甜菜幼苗的相对含水量(96.94%)、丙二醛含量(17.22μmol/L)以及植株形态基本恢复到了正常水平;而高浓度PEG胁迫复性后,9%PEG处理的植株的相对含水量虽然恢复了8.48%左右,但丙二醛含量仍旧相对含量高达36.46μmol/L;而脯氨酸在各组处理中,一直维持在较高水平。qPCR分析表明,干旱胁迫诱导BvGS基因受到了不同程度的诱导表达,分别是处理前的3.85、4.45、5.81、8.20倍左右,即使恢复生长,植株中该基因的表达量虽然有所下降,但仍旧维持在较高水平。因此,可以推测,甜菜幼苗通过调整细胞水势、氧化还原水平、光合作用以及渗透代谢平衡来适应干旱胁迫所带来的失水和质膜过氧化等不良反应,并有可能通过谷胱甘肽的合成来解毒由干旱逆境所带来的氧化伤害。

甜菜谷胱甘肽S-转移酶基因家族鉴定及在镉胁迫下的响应分析

为了研究谷胱甘肽S-转移酶基因(GST)家族在甜菜(Beta vulgaris)中对其生长发育及受到非生物胁迫时的潜在功能,以甜菜BvGSTs家族为研究对象,对其理化性质、进化关系、顺式作用元件、染色体定位及在镉胁迫下的转录表达特性进行深入地分析。结果表明:甜菜基因组中共有52个BvGSTs基因家族成员,分布于7个亚家族中;它们的相对分子质量在17~28 kDa,理论等电点pI在5.16~6.77,大部分成员定位于细胞质。BvGSTs结构中共发现9个motif,其中motif 8为Phi亚家族所特有。30个BvGSTs分别位于8条甜菜染色体,存在4处串联重复。根据顺式作用元件分析,甜菜BvGSTs可参与多种生物与非生物胁迫响应。转录组学分析发现全部52个BvGSTs均不同程度的参与到甜菜对镉胁迫的应答过程。其中在地下部,大多数Tau亚家族成员的表达受到镉胁迫的正向调控;在地上部,Phi亚家族受镉胁迫的显著诱导,Tau亚家族的表达被抑制。qRT-PCR分析表明,4个差异表达显著的BvGSTs的转录受到了镉胁迫调控,并与转录组测序结果相符。上述结果为进一步对甜菜谷胱甘肽S-转移酶在镉胁迫过程中的生物学功能的研究奠定基础。

甜菜热激蛋白基因BvHSP18.2的克隆和生物信息学分析

旨在通过基因克隆及生物信息学分析,预测甜菜小分子热激蛋白BvHSP18.2(LOC104903994)的功能。以甜菜‘780016B/12优’为试验材料克隆BvHSP18.2,获得BvHSP18.2基因全长;通过ProtParam tool、SWISS-MODEL、MEGA11等对BvHSP18.2的理化性质、蛋白结构、多序列比对等信息进行分析。RT-PCR扩增得到的BvHSP18.2基因全长为962 bp,编码158个氨基酸,分子式为C_(928)H_(1466)N_(266)O_(284)S_(6),属亲水性不稳定的小分子热激蛋白家族;该基因编码蛋白含13个磷酸化位点,α螺旋和无规则卷曲等主要构件。进化关系发现BvHSP18.2与藜麦、菠菜的sHSP同源性相似。同时,BvHSP18.2基因启动子区域具有参与防御和应激反应等顺式作用元件,推测其在甜菜生长发育和胁迫应答中发挥重要作用。本结果为进一步开展该基因的功能和遗传调控机制研究奠定了基础。

甜菜C_(2)H_(2)型锌指蛋白转录因子家族全基因组鉴定及镉胁迫下的表达分析

甜菜作为一类新兴的能源作物,在重金属污染土壤的修复中具有潜在的优势。探究镉胁迫下甜菜的应答机制,对于培育耐重金属胁迫的甜菜新种质以及生态修复具有重大意义。锌指蛋白转录因子(zinc-finger proteintranscription factor)是植物中广泛存在的基因家族,全方面参与植物的生长发育,并响应生物和非生物胁迫。本研究通过全基因组鉴定以及理化性质、基因结构、保守基序、染色体定位和顺式作用元件分析发现,甜菜体内共有32个C_(2)H_(2)型锌指蛋白转录因子家族成员,可分为3个亚族,各成员具有数量不等的锌指结构域且不同亚族成员的基因结构及序列特征存在较大差异。通过对镉胁迫下的甜菜C_(2)H_(2)型锌指蛋白转录因子的表达和差异表达基因的调控网络分析发现,BVRB_6g137660、BVRB_8g189640、BVRB_1g000840和BVRB_007840在镉胁迫下表达量均不同程度上调,且可能调控了镉胁迫下甜菜金属耐受蛋白及ABC转运蛋白等重要基因的表达,推测这些转录因子在提高甜菜镉耐受性方面起到了关键作用。