马铃薯Y病毒两个黑龙江烟草分离物的全基因组序列分析

为明确黑龙江烟区马铃薯 Y 病毒(Potato virus Y,PVY)分子株系和进化特征,从哈尔滨和牡丹江感病烟草采集到Harbin 和 MDJ 两个样品,通过 RT-PCR 扩增了其全基因组序列,并进行了一致率、重组、系统发育和选择压力等分析。结果表明,2 个分离物(GenBank 登录号分别为 MH933741 和 MH933742)基因组全长均为 9699 核苷酸。Harbin 与 MDJ 和比利时分离物 GBVC 26(JQ969039)一致率最高,为 98.5%;MDJ 与 Harbin 和 GBVC 26 一致率最高,为 98.5%。Harbin 是美国分离物 Oz和瑞士分离物 N-605 的重组体,MDJ 是美国分离物 CW 和 N-605 的重组体。利用全基因组序列构建的系统进化树显示,PVY 分离物分为 9 个组,Harbin 和 MDJ 均属 PVYN-Wi 组。PVY 的 11 个基因均处于负选择,其中 NIa 蛋白基因的选择压力最大。

3个黑龙江烟区烟草花叶病毒分离物的全基因组序列测定与分析

为明确黑龙江烟区烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)分子株系和进化特征,从哈尔滨和牡丹江感病烟草采集到HEB1、HEB2和MDJ三个样品,通过RT-PCR扩增了其全基因组序列,并进行了一致率、重组、系统发育和选择压力等分析。结果表明,3个分离物全长均为6395核苷酸(GenBank登录号分别为MH595919、MH595920和MH595921)。HEB1和MDJ与辽宁分离物Beipiao(HE818412)一致率最高,分别为98.9%和99.6%;HEB2与云南分离物Chuxiong1(HE818417)一致率最高,为97.1%。HEB1是MDJ和HEB2的重组体。在根据全基因组序列构建的系统进化树中,TMV分为3个组,其中HEB1和MDJ均属Ⅰ(U1)组,HEB2属Ⅱ(Rakkyo)组。TMV的4个基因均处于负选择,其中衣壳蛋白基因的选择压力最大。

普通烟草KCS基因家族的鉴定及非生物胁迫表达模式分析

【目的】为探究烟草KCS基因在非生物胁迫下所起的作用。【方法】采用生物信息学方法对烟草KCS基因进行系统进化、共线性和表达模式等分析。【结果】从普通烟草中鉴定出41个KCS基因;拟南芥和新鉴定的烟草KCS基因可划分为8个亚组,大部分亚组均含拟南芥和烟草成员;10个NtKCS成员源自全基因组复制事件,NtKCS10和NtKCS11是AtKCS02的同源基因,可能具有相似的生物学功能;普通烟草KCS基因启动子含多个与胁迫相关的顺式作用元件,其成员的表达具有一定的组织特异性;在盐和干旱胁迫下,NtKCS09、NtKCS11和NtKCS16表达量均有提高,可能参与烟草胁迫响应等信号传导过程。【结论】本研究对普通烟草KCS家族成员进行了系统的鉴定与分析,为深入研究烟草KCS家族基因的生物学功能奠定理论基础。

黑龙江省烟草病虫害防治中存在的问题及对策

多年来,黑龙江省烟叶生产在科技兴烟战略思想的指导下,在烟草病虫害综合防治技术上进行了大量的研究和推广应用,全省烟草病虫害预测预报及综合防治网的作用得到了充分发挥,烟农主动预防意识大大提高,烟草赤星病、病毒病等大流行现象已基本得到控制。但实践中仍然存在着许多问题和潜在危险,如种植品种结构单一,轮作制度无法实现,大量使用无机化肥,过分依赖化学农药,品种抗性逐年下降,病虫抗药性增强,新病虫害逐年增多,主要病虫害发生变化等,增加了种烟的风险,制约着烟叶生产的可持续发展。结合近年黑龙江省烟草病虫害防治的现状,剖析了病虫害防治存在的问题,提出了相应的对策。

HAL1基因转化烟草提高烟叶含钾量研究

提取酿酒酵母总RNA进行RT-PCR反转录,根据HAL1基因(GeneID:856113)序列设计阅读框引物,对反转录产物进行PCR扩增,并进行全序列测定,构建筛选标记为带内含子的Km抗性基因的植物双元表达载体,经根癌农杆菌介导法将HAL1基因导入烟草品种龙江911和K326中,进行卡那霉素抗性筛选、GUS染色、目的基因扩增和HAL1基因mRNA荧光定量PCR检测,并对T1代各转化烟草材料烟叶含钾量进行化验分析。测序结果证实PCR扩增得到的DNA与酿酒酵母HAL1基因序列相同,获得抗卡那霉素、GUS阳性的转化植株12株。经PCR扩增检测证实HAL1基因已整合入转基因烟草的基因组,荧光定量PCR分析结果表明HAL1基因已在烟苗根系表达,烟叶含钾量化验结果证明HAL1基因可使烟叶含钾量提高30%。

荧光假单胞杆菌G20-9拮抗烟草赤星病菌研究

在室内测定了荧光假单胞杆菌菌株G20-9对烟草赤星病菌的拮抗作用。结果表明,G20-9菌株的无菌发酵液对烟草赤星病菌丝生长量有较强抑制作用,抑制效果为82.1%,稀释2倍的无菌发酵液对菌丝生长的抑制效果优于化学杀菌剂菌核净。应用双抗标记法测定了G20-9菌株在烟草叶面和根际的定殖情况,结果表明,该菌可以在烟草叶面和根际定殖。

转基因烟草荧光定量检测方法研究

依据实时定量PCR原理,参照35S启动子、NOS终止子、GUS基因和NPTII基因序列设计TaqMan引物和荧光标记探针。采用美国MJ公司OpticonTM2荧光定量PCR检测系统对烤后烟叶进行转基因定量检测技术研究,从中筛选出扩增效率高,灵敏度好的PCR引物和探针序列,同时通过对扩增体系,扩增条件的梯度实验,优化出荧光定量检测的最佳反应体系和反应条件,从而建立了转基因烟草定量检测方法。该方法经验证其检测灵敏度达到0.05％。在2003年6月参加CORESTA(国际烟草科研与合作中心)组织的国际烟草转基因定量检测合作试验中,该优化转基因烟草定量检测技术获得了较好成绩,对盲检样品检测结果评价(Z-score)列国际12家实验室之首,证明此法灵敏度高、稳定性好。

转拟南芥AtNHX1基因促进烟草对钾吸收的研究

提取拟南芥总RNA,反转录合成Na＋/H＋逆向转运蛋白基因AtNHX1,构建了植物高效表达载体,用叶盘法将其导入烟草,经筛选获得了抗卡那霉素和GUS染色阳性的转化子38株。应用荧光定量PCR方法对转化材料部分含AtNHX1基因的烟草内源钾通道基因、烟草K＋转运蛋白基因和烟草焦磷酸酶基因的转录水平进行了分析。结果表明：在转化烟草中可以检测到AtNHX1基因mRNA,与未转化材料相比,烟草钾离子转运蛋白基因NtHAK1的转录降低,H＋-ATPase基因NHA1转录增加,钾通道基因NKT转录无显著变化,T1代转化烟叶中K＋含量显著增加,Na^＋、Ca^2＋无显著变化,烟叶中总糖含量降低,证明了编码拟南芥AtNHX1基因与植物的K＋吸收有关。

荧光假单菌菌株7-5对烟草炭疽病菌抑制作用的研究

从烟草根际分离的荧光假单胞菌7-5菌株,在室内条件下对烟草炭疽病菌进行生物拮抗性测定。结果表明,荧光假单胞菌7-5菌株对烟草炭疽病菌有较强的拮抗作用,使培养中的烟草炭疽病菌的菌丝出现菌丝壁溃解、细胞质浓缩、菌丝扭曲变形,同时还发现烟草炭疽病病菌孢子萌发受到抑制。

转基因烟草定性检测方法的研究

本文总结多年的试验研究结果,提出了一套较为完善的转基因烟草定性检测技术,应用该技术,能使转基因烟草的检测精确度由常规PCR的0 . 1%提高到0 . 0 0 5 %。该技术在两次CORESTA转基因烟草盲检合作试验及多年的进出口烟叶、卷烟制品的转基因检测工作中得到广泛的验证。

关于烟草育苗温度和光照强度调控问题的研究

通过对黑龙江省烟草双棚育苗的温度和光照强度调控问题的研究，得出苗床期日均温度应保证１５．３～１９．９℃，平均最低温度７．５～１２．０℃，平均最高温度２８．４～３２．７℃，活动积温８７６．７～１１１２．２℃，有效积温３３９．２～５５２．２℃，需水量要求每平方米５８．８～７３．２升，子床期白天光照强度控制在１．６～２．６万勒克斯，床土养分要求ｐＨ值６．８，有机质含量１５．７％，砂含量６６。９％，碱解氮３５５ｐｐｍ，速效磷６８２ｐｐｍ，速效钾１４８３ｐｐｍ。达到上述条件，基本满足了烟苗生长发育的需要。

烟草灰霉病侵染条件的研究

烟草灰霉病是黑龙江烟区新发现病害，个别地块已造成严重损失。自１９９０～１９９５年利用田间试验和控制条件接种方法，研究了烟草灰霉病病菌侵染来源和侵染规律，试验发现：①灰霉病菌Ｂｏｔｒｙｔｉｓｃｉｎｅｒｅａ侵染烟株的最适宜温度在１８℃左右，９℃以下或２７℃以上不能发生侵染，该菌发生侵染还必须满足９ｈ以上的湿润时间，１２～２４ｈ持续湿润利于侵染，光照对病菌侵染有抑制作用。②病菌的侵染来源主要是来自烟株病残体产生的分生孢子。③黑龙江烟区有两个侵染高峰，一个在６月中、下旬，另一个在８月中、下旬。这期间低温、多雨侵染率较高。

烟草转基因检测方法的研究

通过试验研究，提出了烟草转基因检测方法和标准，首先提取样品DNA采用260－280nm波长扫描测定提取物DNA浓度和纯度，并利用叶绿体不编码蛋白基因序列PCR扩增确定模板质量，同时进行35s启动于，NOS终止子的PCR扩增，对于未出现特异性扩增的样品进行35s和NOS的巢式PCR反应，对于出现目标长度片段扩增的样品再次提取DNA重复检测，并利用限制性内切酶酶切、巢式PCR、探针杂交和目的基因序列扩增进行验证，确定所转目的基因种类。并应用竞争性PCR测定样品中转基因阳性成分含量。

应用0．3％科生霉素防治烟草赤星病研究

科生霉素可显著抑制赤星病菌孢子萌发，使其丧失萌发能力或产生畸形芽管，并能抑制菌丝生长，早期预防可延迟赤星病发病期１０天左右，病害发生后可有效控制病斑扩展和新病斑的产生。稀释倍数２００倍以内施用三次，防治效果在７０％以上。

烟草赤星病对烟叶内在化学物质及品质影响的研究

烟草赤星病对烟叶的质量影响很大，经过连续三年的试验研究结果表明随着烟叶病情的加重，烟碱、粗蛋白、氮的含量增高，而总糖的含量减少，施木克值和糖碱比下降。

黑龙江省白肋烟晾制技术

黑龙江省白肋烟晾制技术金庆国（黑龙江省牡丹江市烟草公司）刘德育，赵光伟（黑龙江省烟草科学研究所）白肋烟是混合型卷烟的重要原料，随着混合型卷烟工业的不断发展，对白肋烟的需求量愈来愈多。为此，我们于１９８７年开始进行白肋烟试种，并探索白肋烟的栽培及晾制技...

降氮增施有机肥对烤烟生长发育和产量的影响

为了提高烤烟质量和经济效益,以龙江986为供试品种进行随机区组试验,设置5个处理,对不同处理烤烟农艺性状、干物质积累、叶绿素含量及经济性状进行测定,以此分析不同施肥配比条件下烟株生长发育及经济性状的变化情况。结果表明,施用肥料的处理其各项农艺性状指标均优于未施肥的对照处理,其中F3(硝酸钾+精制有机肥)和F5(硝酸钾+烟秆有机肥)处理效果最好。增施有机肥及仅施硝酸钾均能够促进烟株的生长,但仅施硝酸钾的效果没有配合施用有机肥的效果好。有机肥与硝酸钾配合施用有利于增加烟株根、茎、叶的干物质积累,与F2(只施硝酸钾)处理相比,团棵期效果最好的为F4(硝酸钾+蚯蚓有机肥)处理,根增加0.40 g,茎增加0.86 g,增加叶重2.25 g;始采期效果最好的为F3处理,茎增加6.64 g,叶增加3.67 g。有机肥与硝酸钾配合施用能够提高烟株叶绿素含量,与F2处理相比,F3处理SPAD值增加1.0,F4处理增加1.6,F5处理增加0.9。此外,有机肥与硝酸钾配合施用能够提升烟株的产量及品质,与F2处理相比,F4处理的单叶质量最大,为5.71 g;产量最高,为1 465.95 kg·hm^(-2),对提高烟株的单叶质量及增产作用效果较好;F5处理的上等烟率最高,为7.05%,可明显改善烟株的品质。综合来看,降氮增施有机肥对烤烟生长发育和产量存在正向促进的作用。F3处理有利于改善烟株农艺性状,F4处理在干物质积累、提高叶绿素含量、单叶质量和产量方面存在一定优势,F5处理有利于提高上等烟率。在生产过程中可以结合具体需求筛选合适的处理或者搭配使用。

应用RNAi技术培育抗2种病毒病的转基因烟草

分别提取烟草普通花叶病(TMV)和烟草黄瓜花叶病(CMV)的病毒RNA。经反转录和外壳蛋白阅读框PCR扩增,获得TMV和CMV外壳蛋白基因cDNA,分别进行两种病毒已知株系cDNA序列比对获得各自的保守序列。设计干涉序列,将干涉片段扩增产物连接到pMD18-T的相邻酶切位点,制备融合序列,并将其正向和反向序列插入pUCCRNAi载体,再转化到pCAMBIA2300-35S-OCS表达载体中。利用农杆菌LBA4404侵染烟草K326,获得3份含有TMV和CMV外壳蛋白基因干涉序列的转化材料,经分子鉴定证实干涉序列已导入烟草。采用荧光定量PCR技术对其mRNA表达差异进行分析。抗病性调查表明转化烟株对TMV和CMV抗性都显著增强。

转拟南芥AtKup1基因高含钾量烟草获得

提取拟南芥幼根总RNA,进行RTPCR逆转录,产物测序,将其构建到含Km(带内含子)筛选标记的植物双元表达载体上,根癌农杆菌介导法将AtKup1基因导入烟草,对转化子进行PCR扩增、GUS染色、Southern杂交和AtKup1基因mRNA荧光定量PCR分析,并进行烟叶内在成分化验分析。PCR获得2100bp左右扩增产物,测序结果证实扩增产物序列与拟南芥AtKup1基因(GenbankNo:AF029876)一致;得到GUS染色阳性的AtKup1基因转化烟草材料29株。经PCR扩增、分子杂交检测证实AtKup1基因已整合到转基因烟草的基因组,荧光定量PCR分析可以在幼根中检测到AtKup1基因的mRNA转录。烟叶含钾量化验结果表明导入的AtKup1基因在转化材料中成功表达,使烟叶含钾量提高约45%。