大鼠肝细胞系BRL-3A细胞Hsp70过表达条件的优化

为了使热休克蛋白70(heat shock protein 70,Hsp70)在BRL-3A细胞中过表达,试验以带有标签基因的腺病毒感染BRL-3A细胞,根据感染效率初筛病毒感染的最适浓度和作用时间;然后用初筛出的最适浓度(4×107,2×107,1×107,0.5×107,0.25×107pfu/mL)和时间(24 h和48 h)感染BRL-3A细胞,优化Hsp70重组腺病毒感染BRL-3A细胞的条件,并应用荧光定量RT-PCR和免疫蛋白印记方法检测Hsp70的mRNA和蛋白表达量。结果表明:当用1×107pfu/mL病毒AdCMV-Hsp70按照最佳感染条件的感染复数(MOI)=20感染BRL-3A细胞48 h时,能使Hsp70表达量比病毒空载体感染细胞和无病毒的对照组细胞极显著升高(P<0.01)。

海兰褐蛋鸡卵巢与输卵管FSHR及LHR基因定量的研究

为了研究鸡卵巢、输卵管子宫部、输卵管漏斗部FSHR及LHR基因表达水平差异,实验从海兰褐蛋鸡的子宫部、卵巢、漏斗部中提取总RNA,利用RT-PCR技术获得FSHR、LHR目的基因,并应用实时荧光定量PCR进行定量检测。结果显示卵巢组织FSHR m RNA表达水平显著高于子宫部与漏斗部组织(P<0.01),子宫部与漏斗部组织FSHR m RNA表达水平没有显著性差异;子宫部组织LHR m RNA表达水平极显著高于其他两组(P<0.01),但卵巢、漏斗部组织LHR m RNA表达水平没有显著性差异。实验通过研究鸡卵巢、输卵管子宫部、输卵管漏斗部FSHR及LHR基因表达水平差异,研究为今后研究禽类生殖生理提供基础数据和科学依据。

籽鹅卵泡颗粒细胞α-烯醇化酶基因RNA干扰表达质粒的构建及鉴定

目的构建籽鹅卵泡颗粒细胞α-烯醇化酶(α-enolase,ENO1)基因RNA干扰表达质粒,并进行鉴定。方法利用RNAi Designer等网络在线RNA干扰设计软件设计3条可能会干扰籽鹅卵泡颗粒细胞ENO1基因表达的插入DNA序列:shRNA-ENO1-350、shRNA-ENO1-892、shRNA-ENO1-591,将体外合成的3条干扰序列分别与线性化的pGPU6/GFP/Neo载体连接,构建ENO1 RNA干扰表达质粒,在Lipofectamine 2000的介导下转染原代培养的籽鹅卵泡颗粒细胞,转染48 h后,荧光倒置显微镜下观察GFP的表达;实时荧光定量PCR和Western blot法检测转染细胞中ENO1基因mRNA的水平及蛋白的表达水平。结果 pGPU6/GFP/Neo-shDNA重组质粒经单酶切及测序证实构建正确;转染后48 h,转染重组质粒的颗粒细胞在荧光倒置显微镜下可见较强的绿色荧光,转染效率可达60%;与培养液组、转染试剂组和无关序列干扰组(shNC)相比,shRNA-ENO1-350组颗粒细胞中ENO1基因mRNA水平和蛋白表达水平均显著降低(P<0.01),其他各组之间差异无统计学意义(P>0.05)。结论成功构建了籽鹅卵泡颗粒细胞ENO1基因RNA干扰表达质粒,在原代培养的籽鹅卵泡颗粒细胞中,其表达量显著下降,为后续有关ENO1功能的研究奠定了基础。