松材线虫潜育期延长导致红松越年枯死

【目的】探究红松越年枯死的病理学过程和产生原因,以期为有效除治无松材线虫病症状的携带者松树提供理论依据。【方法】统计抚顺市大伙房实验林场自然侵染红松越年枯死比例,观测自然侵染和人工接种红松病症病状,测定红松当年显症的松材线虫数量阈值。实验室内不同温度下测定松材线虫虫口增长情况,以及媒介昆虫羽化后适宜松材线虫虫口有效增长的时期(虫口增长期),计算从寄生关系的建立到症状开始出现的时间(潜育期),并揭示红松感染松材线虫后越年枯死的原因。【结果】截至6月,自然侵染红松的越年枯死比例为41.4%。观测的自然侵染和低剂量人工接种红松在被侵染或接种当年均未出现显著外部、内部症状变化,而是到翌年松脂分泌停止,树干水分低,针叶变红褐色,只有进行高剂量饱和接种才出现当年半数显症。病症表现为松材线虫能够正常侵染红松,可有效繁殖但在低温时繁殖受阻,可成功越冬但越冬后虫口数量骤减。红松显症的全株阈值St1=(163±22)条·g^(-1),局部阈值St2=(621±20)条·g^(-1)。以每株50000条的接种量接种38年生红松,在当年虫口增长期内全株松材线虫数量仅为(90±8)条·g^(-1),低于St1、局部松材线虫数量最高为(350±18)条·g^(-1),也低于St2。抚顺的虫口增长期(141天)比大连(154天)和南京(173天)短。经计算,抚顺市松材线虫的潜育期为146天,长于虫口增长期。【结论】云杉花墨天牛携带的松材线虫数量相对较低,导致初始侵染量低。松材线虫生命周期受温度特性的影响,表现为非增长期长、虫口增长期短,最终导致在虫口增长期内未能达到红松显症的松材线虫数量阈值。这些综合作用导致松材线虫潜育期延长,其中41.4%的死亡红松表现出越年枯死现象。

温度调控ALP1表达对叶状枝节丛孢捕食松材线虫效率的影响

转录组测序筛选并克隆了叶状枝节丛孢丝氨酸蛋白酶基因ALP1,并通过生物信息学分析揭示了其对松材线虫捕食效率的影响。结果表明:ALP1编码的蛋白质是一个409个氨基酸残基的分泌性蛋白,分子质量为41.89 ku,等电点为6.45,表现出稳定且亲水的蛋白质特性。ALP1蛋白无跨膜螺旋,含有信号肽,预测的切割位点位于第21至22个氨基酸残基间。ALP1蛋白含有丝氨酸蛋白酶家族的保守基序,其二级结构主要由α螺旋、无规卷曲和β-折叠组成,与Drechslerella coelobrocha丝氨酸蛋白酶基因具有高度同源性。实时定量PCR(RT-qPCR)结果表明,ALP1基因表达水平与叶状枝节丛孢的捕食效率呈正相关,尤其在28℃时表达显著上调。在18~32℃梯度范围内,以28℃为叶状枝节丛孢捕食效率最优温度条件。GO分类和通路富集分析进一步确认了ALP1在叶状枝节丛孢适应环境和捕食过程中的核心作用。ALP1基因在叶状枝节丛孢适应温度变化和提高捕食效率中起到关键调控功能,还为松材线虫病的生物防治提供了新的策略和基因资源。

松材线虫Bx-TIMP克隆及功能研究

为探究Bx-TIMP基因在松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)致病过程中的功能,对Bx-TIMP基因进行克隆及分析,并验证基因沉默后松材线虫致病性变化。PCR法克隆Bx-TIMP,应用TMHMM 2.0 server和SignalP 4.1 Server分析该基因编码蛋白质的跨膜结构域和信号肽;应用原位杂交技术确定该基因在松材线虫体内表达部位;应用RNAi技术,分析沉默该基因后松材线虫对红松(Pinus koraiensis)致病性变化。该基因CDS区全长363 bp,编码120个氨基酸,编码蛋白具有跨膜结构域及信号肽。原位杂交表明该基因在松材线虫食道腺中表达。基因沉默后,松材线虫对红松致病性减弱。结果表明,Bx-TIMP为效应因子基因,与松材线虫致病性相关。本研究揭示Bx-TIMP基因是松材线虫危害松树致使其发病的关键基因,为进一步明确松材线虫致病机理提供理论依据,为研发松材线虫的防治技术奠定理论基础。

美国白蛾对摩西球囊霉定殖银中杨的适应和生理响应

【目的】探明美国白蛾对丛枝菌根真菌(AMF)定殖银中杨的适应和生理响应,为揭示AMF在林木与植物昆虫之间的相互作用奠定基础,为利用AMF诱导增强林木化学防御提供理论依据。【方法】对银中杨扦插苗进行外源接种摩西球囊霉(GM),在GM侵染率达到最高时(90天),采叶饲喂美国白蛾幼虫,观察美国白蛾幼虫的生长发育、食物利用情况,分析其消化酶和解毒酶的活性变化。【结果】与对照相比,取食GM侵染的树叶后,3~6龄幼虫体质量均不同程度的低于CK,但差异不显著;2~5龄幼虫发育历期显著延长,且3龄和5龄幼虫相对生长率显著降低;美国白蛾5龄幼虫食物消耗率无显著差异,食物转化率和利用率被抑制;6龄幼虫食物消耗率、转化率和利用率均无显著差异。5龄幼虫脂肪酶活性显著增加,谷胱甘肽-S-转移酶(GSTs)活性被抑制,蛋白酶和淀粉酶、羧酸酯酶(CarE)活性与对照无显著差异。6龄幼虫脂肪酶、蛋白酶和淀粉酶、GSTs和CarE活性均显著高于对照。【结论】接种GM的银中杨对美国白蛾的生长发育和食物利用在短时间内有一定抑制作用,美国白蛾会通过提高消化酶和解毒酶活性来突破这种抑制作用,维持正常生长发育。

松材线虫效应因子基因筛选及Bx-Hh-grl功能研究

【目的】通过对松材线虫效应因子基因的克隆和功能研究,揭示Bx-Hh-grl对松材线虫致病性的作用,为防治松材线虫提供理论依据。【方法】用松材线虫Bx1022株系接种黑松,20 d后提取线虫总RNA进行转录组测序,将该转录组设为松材线虫植食阶段转录组。提取由灰葡萄孢(Botrytis cinerea)培养的Bx1022的总RNA进行转录组测序,将该转录组设为菌食阶段转录组。比较分析两个转录组,筛选到差异表达基因Bx-Hh-grl。对Bx-Hh-grl编码蛋白质的跨膜结构域和信号肽进行预测。利用原位杂交检测Bx-Hh-grl表达部位。应用RNAi技术干扰Bx-Hh-grl表达以探究Bx-Hh-grl对松材线虫致病性的作用。通过Q-PCR验证,确定RNAi效果显著。将经RNAi处理的松材线虫接种3年生黑松枝条,以未经处理的松材线虫(CK组)和ddH2O(Mock组)处理的黑松作为对照,比较黑松发病情况进而比较不同处理后松材线虫的致病性差异。【结果】筛选出植食阶段与菌食阶段转录组差异表达基因Bx-Hh-grl,其编码蛋白质具有跨膜结构域和信号肽。原位杂交试验结果显示Bx-Hh-grl在松材线虫食道腺表达,符合效应因子基因特征。Q-PCR结果显示经RNAi处理后的松材线虫Bx-Hh-grl表达量下调,RNAi处理效果显著。接种实验表明,Bx-Hh-grl-RNAi组显症的时间明显晚于CK组,Mock组黑松一直保持健康状态。【结论】Bx-Hh-grl是与松材线虫致病相关的效应因子基因。明确Bx-Hh-grl功能有利于进一步了解松材线虫致病机理,为降低松材线虫危害,防治松材线虫奠定理论基础。

Pk-αts高表达提高红松对松材线虫耐病性

松材线虫的北扩已经在东北局域引发毁灭性灾害,对东北林区顶级生态群落的重要组成树种红松构成重大威胁。对丰富红松与松材线虫互作分子机理的研究,为耐病红松选育奠定理论基础。人工接种鉴定20个家系红松对松材线虫的耐病性差异,并将不同家系红松分为耐病、感病和高感3类。提取耐病和高感红松核糖核酸(RNA)进行转录组测序,筛选并克隆红松耐病相关的α-松油醇合酶基因Pk-αts。RT-qPCR随机检测4个耐病、2个感病和4个高感红松Pk-αts表达量,计算此10个家系红松相对耐病指数,分析Pk-αts表达量与红松相对耐病指数的相关性。结果表明,接种松材线虫20 d后耐病红松仅数根针叶褪绿,平均相对耐病指数为0.88,而高感红松表现出局部松针变红,平均相对耐病指数为0.09。转录组鉴定到在耐病红松差异上调表达且在高感红松无变化或下调表达的基因1770个,其中Pk-αts在耐病红松的相对表达量为2.83,极显著,但在高感红松中相对表达量为-1.27。基因克隆得到Pk-αts长度为1230 bp。该基因编码蛋白质由409个氨基酸构成,等电点为5.55,相对分子质量为47.60 ku,经比对后与α-松油醇合酶基因同源性最高,且含有植物单萜烯合成酶DDxxD、RRx 8 W保守基序及Terpene_synth等结构域,符合单萜烯合成酶结构特征。RT-qPCR检测耐病红松的Pk-αts基因表达上调(平均表达量为1.39),感病和高感红松Pk-αts基因不变或下调表达,表明在侵染早期,Pk-αts基因的上调表达与红松耐病时空同步。Pk-αts表达量与红松相对耐病指数显著正相关(皮尔逊系数为0.911,P<0.01),表明Pk-αts基因的上调表达提高了红松耐病性。综上所述,不同家系红松对松材线虫耐病性不同,部分红松具有一定耐病性,Pk-αts基因上调表达减轻了发病症状,有助于提高红松对松材线虫的耐病性。以Pk-αts基因作为检测靶标可用于红松耐病性鉴定,有助于耐病红松选育。

松材线虫Bx-HSF-1转录激活活性研究

【目的】通过研究松材线虫热激转录因子Bx-HSF-1转录激活活性及其靶基因在松材线虫7个虫态(龄)的表达量,揭示Bx-HSF-1在松材线虫生长发育过程中的具体功能。【方法】构建pGBKT7-Bx-hsf-1重组质粒,转化酵母AH109菌株,验证Bx-HSF-1的转录激活活性。应用RNA干扰(RNAi)和转录组技术鉴定Bx-hsf-1基因沉默后松材线虫差异表达基因。对差异表达基因进行基因互作分析,筛选出受Bx-HSF-1调控的靶基因。应用RT-qPCR鉴定5条靶基因在J_(2)、DJ_(3)、DJ_(4)、J_(3)、J_(4)、雌成虫和雄成虫共7种虫态(龄)中的表达量。【结果】转入pGBKT7-Bx-hsf-1重组质粒的酵母AH109菌株能够在SD/-Trp和SD/-Trp/-His/-Ade培养基上正常生长,并且在SD/-Trp/-His/-Ade+X-α-gal培养基中显蓝色,表明Bx-HSF-1能够激活下游报告基因表达,具有转录激活活性。通过荧光显微观察及RT-qPCR验证,RNAi处理12 h后靶向siRNA可顺利导入松材线虫细胞,且有效抑制Bx-hsf-1的表达。RNAi处理后转录组数据分析共鉴定到110条差异表达基因,其中86条下调表达。基因互作分析筛选到5条靶基因(Bx-daf-21、Bx-hsp-1、Bx-hsp-70、Bx-sti和Bx-cdc),通过RT-qPCR对这5条靶基因在7种虫态(龄)中的表达量进行分析。在7种虫态(龄)中,Bx-daf-21与Bx-hsf-1的表达量变化趋势一致,Bx-hsp-70与Bx-hsf-1表达量变化趋势相反,Bx-sti和Bx-hsp-1与Bx-hsf-1表达量变化趋势无相关性。在DJ_(3)中,Bx-cdc与Bx-hsf-1表达量变化趋势相反。【结论】松材线虫Bx-HSF-1具有转录激活功能,通过转录调控参与松材线虫各虫态(龄)发育过程。