miR-23b通过靶定TAB2/3抑制糖尿病肾病纤维化

MicroRNAs(miRNAs)通过与靶基因的相互作用发挥其生物学功能.miR-23b作为抑癌基因,参与了许多肿瘤和自身免疫疾病的发生过程,但其在糖尿病肾病中的作用尚不清楚.为了探讨miR-23b与靶基因TAB2/3作用对糖尿病肾病纤维化的影响,本实验通过建立糖尿病小鼠模型和糖尿病HK-2细胞模型,利用实时定量荧光PCR方法,检测糖尿病小鼠模型肾mRNA表达,发现miR-23b在糖尿病组(Dia组)表达低于正常组(P<0.001).利用Western印迹检测相关蛋白,结果显示,与正常组相比,TAB2/3,FN和α-SMA在糖尿病组高表达,并且TAB2/3在糖尿病组中持续高表达.利用基因转染技术过表达miR-23b可以同时在mRNA和蛋白水平上抑制TAB2/3,P38和ERK1/2的表达,FN表达也显著降低.以上结果显示:miR-23b可能通过作用靶基因TAB2/3及其信号通路下游,抑制糖尿病肾病纤维化.

MicroRNA-25通过调控MAP2K4抑制糖尿病肾病纤维化的研究

目的检测microRNA-25在糖尿病肾病动物模型及不同条件培养下的人肾小管上皮细胞(HK-2)中的表达,探讨其对糖尿病肾病纤维化的调节作用。方法实时荧光定量聚合酶链反应检测microRNA-25的表达。生物信息学预测、细胞瞬时转染和Western blot验证microRNA-25的下游靶蛋白。结果 microRNA-25在糖尿病肾病动物模型及高糖培养下的HK-2中表达降低(P<0.01)。MAP2K4可能是microRNA-25的下游靶蛋白。过表达microRNA-25可以从蛋白水平上抑制MAP2K4、α-SMA的表达(P<0.01)。结论 microRNA-25可以通过调控MAP2K4从而抑制糖尿病肾病纤维化的进展。

重组人转化生长因子β1原核表达及多克隆抗体制备

目的克隆人转化生长因子β1(TGF-β1)基因,原核表达TGF-β1蛋白,制备兔抗人TGF-β1多克隆抗体。方法应用RT-PCR技术扩增人TGF-β1基因序列,构建pET-28a-TGF-β1重组质粒。转化至E.coli BL21(DE3)中,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达。Western-blot检测目的蛋白的抗原性。免疫新西兰白兔,获得兔抗人TGF-β1多克隆抗血清。饱和硫酸铵盐析法纯化多克隆抗体,间接ELISA法检测多克隆抗体效价,Western-blot技术进行抗体特异性检测。结果获得了TGF-β1编码序列和表达载体,目的蛋白主要存在于超声破碎后的包涵体中;经Western-blot检测目的蛋白存在抗原性;获得纯化的兔抗人多克隆抗体效价达1∶10 000。结论获得的兔抗人TGF-β1多克隆抗体效价较高,具有良好的特异性。

TGF-β与肝纤维化的研究进展

转化生长因子-β(transforming growth factor,TGF-β)是最强的促肝纤维化的细胞因子之一,它通过TGF-β信号转导途径参与肝纤维化的发生、发展及形成,探讨TGF-β在肝纤维化的发生、发展及形成过程中的具体机制,对于未来更安全有效的以TGF-β为靶点治疗纤维化具有重大意义。本文就TGF-β与肝纤维化的关系作一综述。

miRNA-23b调节G3BP2-p38在糖尿病肾病纤维化的调控机制研究

目的探讨在糖尿病肾病纤维化中,miRNA-23b对G3BP2-p38通路所起的调控作用。方法选取50只6周龄C57BL/6雄性小鼠,构建糖尿病肾病模型小鼠,随机分为五组,A组:Control;B组:miRNA-23b mimic;C组:mi RNA-23b negative controls;D组:G3BP2-si RNA;E组:p38抑制剂,每组10只。Real-time PCR检测各组G3BP2、p38-MAPK基因表达情况。结果与A组相比,B组p38-MAPK的m RNA表达水平降低,差异有统计学意义(P<0.05);C组与A组结果一致,差异无统计学意义(P>0.05),D组与A组相比,p38-MAPK mRNA水平降低,但mi RNA-23b显著升高,差异有统计学意义(P<0.05)。与A组相比B、D组ACR比值均明显下降。结论mi R-23b在糖尿病肾病中的作用是通过mi R-23b-G3BP2-p38信号通路调节实现,表明了新的潜在治疗靶标。

微生物学课程教学改革与探索

针对微生物学课程教学中存在的问题,从教学内容、教学方法、考核方式、实践教学几方面进行了改革,以调动学生的学习积极性,提高教学质量。

一种新型的截短型转化生长因子-βⅡ型受体的构建

目的设计并构建一种新型的截短型转化生长因子-βⅡ受体(tTGF-βRⅡ)。方法 RT-PCR方法扩增TGF-βⅠ的CDS序列、tTGF-βRⅡ,并将其分别克隆至pGBKT7和pGADT7载体中。利用酵母双杂交和GST-pulldown试验检测tTGF-βRⅡ与TGF-βⅠ间的相互作用。人工合成该tTGF-βRⅡ多肽。结果成功地设计并克隆了一种新的tTGF-βRⅡ,其可以与配体TGF-βⅠ结合。结论制备的tTGF-βRⅡ可以作为TGF-βRⅡ的拮抗剂,竞争性的与TGF-βⅠ结合,为瘢痕治疗奠定了基础。

姬松茸多糖对2型糖尿病大鼠脂肪分化相关蛋白表达的影响

目的探讨姬松茸多糖对2型糖尿病大鼠脂肪分化相关蛋白(ADRP)基因表达的影响。方法将Wistar大鼠随机分为正常对照组、模型组、姬松茸多糖组。8周后,聚合酶链反应检测ADRP基因表达水平。结果姬松茸多糖组ADRP基因的表达低于模型组(P<0.05)。结论姬松茸多糖可降低2型糖尿病大鼠脂肪分化相关蛋白基因的表达。

兔抗人TGF-β_1多克隆抗体的制备

目的以人重组TGF-β1蛋白作为抗原,制备兔抗人TGF-β1多克隆抗体。方法重组蛋白与弗氏佐剂等体积混匀,免疫新西兰白兔,获得兔抗人TGF-β1多克隆抗血清。饱和硫酸铵盐析法纯化多克隆抗体,间接酶联免疫吸附试验检测多克隆抗体效价,Western-blot技术进行抗体特异性检测。结果成功获得兔抗人TGF-β1多克隆抗体,纯化后抗体效价达1∶110 000。结论获得的兔抗人TGF-β1多克隆抗体具有良好的特异性,能满足进一步实验的需要。

炎性环境对骨髓间充质干细胞分泌TGF-β家族分子影响的实验研究

目的:探讨在炎性环境下骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)分泌TGF-β家族分子的特点。方法:采用Real-time PCR、细胞免疫荧光及ELISA等方法分别检测TGF-β家族分子基因和蛋白的表达水平。结果:BM-MSCs可以分泌TGF-β家族分子,并且在炎性因子刺激下其表达明显上调。结论:炎性环境可促进BM-MSCs分泌生物活性因子,对其在创伤愈合中的应用提供了进一步的理论和实验基础。

重组人成纤维细胞生长因子-21对2型糖尿病模型大鼠LXRα及GLUT1 mRNA表达的调节作用

目的研究重组人成纤维细胞生长因子-21(rhFGF-21)对2型糖尿病(T2DM)模型大鼠LXRα及GLUT1mRNA表达的调节作用。方法将T2DM大鼠模型随机分组,每日皮下注射rhFGF-21,8周后,测定大鼠空腹FBG、FA、TG、TC、HDL-C、LDL-C含量,采用RT-PCR方法检测LXRα及GLUT1 mRNA的表达水平。结果(1)rhFGF-21能稳定降低T2DM模型大鼠血糖。(2)rhFGF-21用药组大鼠较T2DM模型组大鼠LXRα和GLUT1 mRNA表达量显著增加。(3)大、中剂量rhFGF-21能显著降低T2DM模型大鼠血清FA、TG、TC、LDL-C含量,同时显著升高血清HDL-C含量。结论rhFGF-21能上调T2DM模型大鼠LXRα、GLUT1 mRNA表达,增加基础水平的葡萄糖转运,从而降低血糖,改善脂质代谢紊乱。

脂氧素A_4对大鼠肺缺血再灌注损伤氧化损伤的影响

目的探讨脂氧素A4对大鼠肺缺血再灌注损伤氧化应激的影响。方法取36只大鼠（体重220-280g）随机分为假手术组、缺血再灌注组和脂氧素A4干预组。阻断左肺门45min后再灌注2h建立肺缺血再灌注损伤模型,脂氧素A4干预组在大鼠恢复血供前5min股静脉注射脂氧素A4 0.1mg/kg。收集标本,检测肺组织的湿/干重量（W/D）比值、支气管肺泡灌洗液的蛋白总量（TP）、检测肺组织匀浆中丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性。结果缺血再灌注组肺组织W/D比值、MDA水平和支气管肺泡灌洗液中总蛋白均较假手术组明显升高,而SOD活性较假手术组明显降低（P〈0.05）。脂氧素A4干预组的上述指标高于明显低于缺血再灌注组,而SOD活性较缺血再灌注组明显升高（P〈0.05）。结论脂氧素A4对大鼠肺缺血再灌注损伤有一定的保护作用,其机制可能是脂氧素A4清除自由基抗氧化作用。

黄芪多糖针对人胃癌细胞SGC-7901体外实验抑制作用

目的:体外研究不同浓度的黄芪多糖对人胃癌细胞SGC-7901增殖的影响。方法:体外培养人胃癌细胞SGC-7901,采用MTT比色法检测不同浓度(6ug/mL、12.5ug/mL、25ug/mL、50ug/mL、100ug/mL)的黄芪多糖提取液对其增殖的抑制作用,并用酶联检测仪在450nm波长处测定其光吸收值,可间接反映活细胞数量。结果:在细胞抑制实验中,加药12h后,浓度高于25ug/mL的黄芪多糖均能表现出对人胃癌细胞SGC-7901的增殖的抑制作用,同时MTT实验结果表明,在药物浓度12.5ug/mL时,人胃癌细胞SGC-7901的增殖因药物浓度低,有上升趋势。随着黄芪多糖的药物浓度增加,在药物浓度50ug/mL^100ug/mL时有明显抑制人胃癌细胞SGC-7901生长的趋势,并呈浓度依赖性。结论:黄芪多糖在体外实验对人胃癌细胞SGC-7901的增值有较强的肿瘤抑制作用。

重组截短型TGF-βⅡ型受体蛋白对肝纤维化大鼠的治疗作用研究

目的:研究截短型TGF-βⅡ型受体蛋白对肝纤维化大鼠的治疗作用。方法:取含有重组截短型TGF-βⅡ型受体载体的大肠杆菌BL21,通过培养繁殖,诱导,纯化得到重组截短型TGF-βⅡ型受体蛋白。使用CCl4诱导的方法来制备肝纤维化大鼠模型,观察截短型TGF-βⅡ型受体蛋白对大鼠肝纤维化的影响。SDS-PAGE检测纯化的截短型TGF-βⅡ型受体蛋白。生化检测血清谷丙转氨酶(glutamic pyruvic transaminase,ALT)及谷草转氨酶(glutamic oxalacetic transaminase,AST)含量。用实时荧光定量PCR(real-time PCR)方法和免疫荧光方法来检测各组大鼠肝组织中的α平滑肌肌动蛋白(alpha-smooth muscle actin,α-SMA),1型胶原(collagen1,Col1)和4型胶原(collagen4,Col4)的表达情况。用HE,MASSON,PAS这三种病理学染色的方法来观察各组大鼠肝纤维化的变化。结果:SDS-PAGE检测结果显示,纯化后获得高纯度截断型TGF-βⅡ型受体蛋白。截短型TGF-βⅡ型受体蛋白治疗组可以减少血清中谷丙转氨酶和谷草转氨酶的含量。截短型TGF-βⅡ型受体蛋白治疗组可以降低肝组织中α-SMA、FN、Col1和Col4的mRNA和蛋白质的表达。三种病理学染色的方法显示,与肝纤维化大鼠模型组相比,治疗组的纤维化程度明显减轻。结论:重组截短型TGF-βⅡ型受体蛋白对大鼠肝纤维化的程度有抑制作用,为治疗肝纤维化及其他纤维化疾病提供了一个潜在的治疗手段。

糖尿病心肌病与miR-1/miR-206和胰岛素样生长因子表达的关系

目的探讨糖尿病心肌病与miR-1/miR-206和胰岛素样生长因子-1(IGF-1)表达量之间的关系。方法C57BL/6小鼠经腹腔注射链脲佐菌素(STZ)建立糖尿病心肌肥大模型,两个月后,取心脏组织,采用Real-Time PCR检测糖尿病心肌病相关基因心房钠尿肽(ANP),B型尿钠肽(BNP),转录共激活因子(P300)和IGF-1以及miR-1/miR-206表达。结果在糖尿病心肌病小鼠模型中,糖尿病心肌病相关基因ANP、BNP、P300、IGF-1基因表达水平显著升高(P<0.01)。同时miR-1/miR-206表达水平显著降低(P<0.01)。结论糖尿病心肌病小鼠miR-1/miR-206以及IGF-1的表达有显著变化,表明在糖尿病心肌病发病过程中可能是由miR-1/miR-206通过调控IGF-1的表达起作用。

PFOS青春期暴露对成年期雄性大鼠的生殖毒性

为探究青春期的PFOS暴露对成年后的SD大鼠的生殖毒性,对出生后第21天(PND21)的SD大鼠经口灌胃不同剂量的PFOS(5、10和20mg·kg^(-1)),连续染毒7d,在出生后第56天(PND56)时,对各染毒组SD大鼠的体质量、精子数量、血清中的睾酮浓度,以及睾丸间质细胞睾酮合成的相关基因mRNA水平进行了检测。结果显示,10mg·kg^(-1)剂量组大鼠体质量较对照组明显下降(P<0.01);精子数量在10mg·kg^(-1)和20mg·kg^(-1)剂量组明显降低(P<0.05);血清中睾酮浓度随着PFOS剂量的加大有明显下降的趋势,20mg·kg^(-1)剂量组显著低于对照组(P<0.05);类/胆固醇相关基因star和cyp11α1的mRNA表达水平明显下调。研究表明,青春期的PFOS暴露会导致睾酮合成途径中相关因子的功能缺失,破坏成熟睾丸间质细胞的功能,致使睾酮水平降低,并抑制精子生成,从而破坏生殖系统的功能。

HPLC法检测蛇莓中齐墩果酸的含量

目的探讨HPLC测定蛇莓中齐墩果酸含量的方法。方法采用Thermo ODS-2HYPERTIL C18(250 mm×4.6 mm,5μm)色谱柱;流动相:0.065 moL/L NaH2PO4溶液-甲醇(14∶86);检测波长:210 nm;流速:0.8 mL/min。结果齐墩果酸在0.19～2.16μg范围内呈良好线性关系(r=0.998 2);平均回收率为98.6%,RSD(n=9)为1.68%。结论此法简单、准确、可靠,可以作为评价蛇莓质量的有效方法。

孕期全氟辛烷磺酸盐(PFOS)暴露诱导胎鼠肺损伤

为研究全氟辛烷磺酸盐(PFOS)暴露对胎鼠肺部损伤的诱导作用,孕期SD大鼠在5～20mg·kg-1剂量范围内的PFOS中处理7d,取胎鼠全肺并分析其发育所受的影响。通过形态学比较,发现随着PFOS浓度的增加,胎鼠体长和体重均显著降低,高剂量暴露会导致胎鼠死亡。通过组织学检测,发现胎鼠肺的发育受到PFOS暴露的抑制。通过WesternBlot检测肺泡Ⅰ/Ⅱ型细胞的发育,发现肺泡Ⅰ型细胞特异蛋白Podoplanin表达显著减少(p<0.05),肺泡Ⅱ型细胞特异蛋白SP-C表达减少但未出现显著差异,此外,与对照组相比高剂量暴露会引起血管内皮生长因子(VEGF)表达显著减少(p<0.01)。实验结果说明,PFOS暴露会导致胎鼠肺部发育出现损伤,这种损伤可能是肺泡Ⅰ型细胞及肺部血管发育受抑制引起胎鼠肺部气体交换功能破坏。

糖尿病肾病发病机制的研究进展

糖尿病是引起晚期肾病的主要原因,糖尿病肾病是不会在缺少高血糖的情况下发生的,甚至在有遗传倾向时没有高血糖也不会导致糖尿病肾病。基因多态性在糖尿病肾病的发生、发展中也有重要作用。近年来,一些学者提出了其有很多因子介入的发病机制。目前治疗糖尿病的主要方法为控制血糖、降血压、控制血脂并禁止吸烟。控制血糖是治疗的关键点,胰腺移植是降低肾损伤的最好方法。

复方水蛭注射液HPLC指纹图谱研究

目的:用高效液相色谱法测定复方水蛭注射液中次黄嘌呤的含量,并建立注射液指纹图谱,全面评价其内在质量。方法:采用Kromasil C18(4.6 mm×250 mm,5μm)色谱柱,流动相A-0.01 mol.L-1KH2PO4,B-50%甲醇,梯度洗脱的方式;流速0.8 mL.min-1,检测波长254 nm;柱温为室温。结果:以次黄嘌呤为参照物,建立了复方水蛭注射液指纹图谱,标示出15个共有峰,共有峰相似度大于0.97。结论:该方法准确、重复性好,可作为控制复方水蛭注射液的质量依据。