黑龙江省某规模化奶牛场牛病毒性腹泻病毒qRT-PCR结合双抗夹心ELISA的检测

为了对黑龙江省规模化奶牛场牛病毒性腹泻/黏膜病进行检疫净化,试验应用qRT-PCR法检测了黑龙江省4个规模化奶牛场(A^D场)奶牛耳组织样品(共1286份,58组),qRT-PCR法检测得到的阳性组样品再用双抗夹心ELISA进行每份样品的检测。阳性牛间隔1个月用RT-PCR方法复检。结果表明:A场牛病毒性腹泻病毒阳性率为0.5%(1/193),B场为0.1%(2/875),C场为1.8%(1/55),D场未检测出牛病毒性腹泻/黏膜病抗原阳性牛(0/163)。间隔1个月,用RT-PCR方法复检,阳性符合率100%。说明qRT-PCR结合双抗夹心ELISA方法适合于规模化奶牛场牛病毒性腹泻/黏膜病的快速、特异性的检疫净化。

氯化-N-十二烷基吡啶-1-乙酰胺杀灭或抑制病原体的活性研究

季铵盐类表面活性剂是一类低毒、高效的广谱消毒剂,能杀灭多种细菌和病毒,在养殖业和医学等领域的消毒中应用前景广阔。研究旨在明确自主合成的季铵盐类表面活性剂氯化-N-十二烷基吡啶-1-乙酰胺(C12cmpC)对禽源致病菌和牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的抗菌抗病毒活性。通过MIC、MBC和时间杀菌试验,明确C12cmpC的体外杀灭、抑制革兰阴性和阳性细菌的效果。通过细胞形态观察、细胞活性检测和BVDV m RNA的qRT-PCR检测,初步明确C12cmpC的抗病毒活性。结果表明,C12cmpC对鹅大肠杆菌(QS195313)的MIC为250 mg·L^(-1),MBC为500 mg·L^(-1)。C12cmpC对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌标准株的MIC为31.25 mg·L^(-1),MBC为62.5 mg·L^(-1)。此外,C12cmpC对MDBK细胞的最大安全浓度为5 mg·L^(-1)。其与BVDV作用1、5、30、60 min后,MDBK细胞中病毒m RNA水平均显著降低。研究表明新型季铵盐类表面活性剂氯化-N-十二烷基吡啶-1-乙酰胺具有较好的抗菌抗病毒活性,研究为新型消毒剂的开发提供了理论依据。

牛溶血性曼氏杆菌对BT细胞炎症因子及其TLR4/NF-κB信号通路影响的研究

为探究牛溶血性曼氏杆菌(Mh)感染新生牛鼻甲(BT)细胞是否发生炎症反应及其涉及的信号通路,本研究将不同浓度的Mh分别感染BT细胞后经MTT法检测Mh对BT细胞的毒性作用,确定合适的感染浓度。结果显示,与空白对照细胞相比,以终浓度1×10^(4)cfu/mL、1×105cfu/mL的Mh感染后BT细胞的存活率均在80%以上;以浓度1×10^(6)cfu/mL的Mh感染BT细胞后的细胞存活率在60%~70%,以终浓度1×10^(7)cfu/mL的Mh感染BT细胞后的细胞存活率在50%以下;因此确定终浓度1×10^(6)cfu/mL为Mh的最适感染浓度。将Mh以终浓度1×10^(6)cfu/mL感染BT细胞后,采用荧光定量PCR(qPCR)检测细胞中细胞因子(IL-1β、IL-6及TNF-α)m RNA的转录水平;采用间接ELISA检测细胞上清中上述各细胞因子的分泌水平;通过western blot检测BT细胞中TLR4/NF-κB通路中Toll样受体4(TLR4)、p-P65、磷酸化NF-κB抑制蛋白(p-IκBα)的表达水平。q PCR和间接ELISA结果显示,Mh感染的BT细胞中促炎因子IL-6、IL-1β、TNF-αm RNA转录水平及蛋白分泌水平均极显著高于空白对照细胞(P<0.001)。Western blot结果显示,与空白对照组相比,Mh感染的BT细胞中TLR4、p-P65蛋白的表达水平显著升高(P<0.05),p-IκBα蛋白的表达水平极显著降低(P<0.01)。本研究首次表明,Mh感染诱导BT细胞发生了炎症反应,并且该炎症反应是通过激活TLR4/NF-κB信号通路及其相关蛋白的表达实现的。本研究为Mh发病机制的研究及其所致疾病的防治提供参考依据。

槲皮素对沙门菌生物被膜形成的抑制作用研究

【目的】研究槲皮素对沙门菌生物被膜形成的抑制作用及其作用机制。【方法】通过结晶紫染色法绘制沙门菌生物被膜生长曲线,测定槲皮素对沙门菌的最小生物被膜抑制浓度(MBIC),并以此浓度槲皮素处理沙门菌,利用XTT法和扫描电镜观察沙门菌生物被膜内细菌的代谢活性和菌膜形态结构;采用苯酚-硫酸法、BCA法和紫外分光光度计检测沙门菌生物被膜胞外多糖、蛋白和胞外DNA含量;通过微生物黏附碳氢法和软琼脂平板法测定沙门菌的疏水性和运动能力。【结果】生长曲线结果显示,沙门菌生物被膜的黏附期、聚集期、成熟期和分散期分别为0~48、48~72、72~120和120~168 h。槲皮素对沙门菌生物被膜的MBIC为256μg/mL。在槲皮素作用下,不同时间沙门菌生物被膜内细菌的代谢活性均极显著降低(P<0.01)。扫描电镜观察发现,槲皮素处理后,沙门菌生物被膜结构被破坏,膜状物质消失。与对照组相比,槲皮素组沙门菌生物被膜胞外多糖、蛋白和DNA含量均极显著下降(P<0.01);沙门菌的疏水性指数、泳动圈直径及群集运动圈直径均极显著下降(P<0.01)。【结论】槲皮素通过影响沙门菌生物被膜内细菌的代谢活性、降低胞外聚合物的生成、干扰沙门菌的表面疏水性和运动能力从而抑制生物被膜的形成。

青蒿素与牛病毒性腹泻病毒NS5B蛋白的分子对接预测及其抗病毒作用

【目的】采用分子对接以及体外试验确定青蒿素对牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)复制的抑制作用,为抗病毒药物和制剂开发提供新思路。【方法】以BVDV-NS5B蛋白为作用靶点,通过PDB数据库检索蛋白三维晶体结构,并对其结构进行适当修饰处理;检索TCMSP数据库中的青蒿素结构,应用Autodock软件将两者进行分子对接及结合能打分。随后采用CCK-8试剂盒测定青蒿素对MDBK细胞的最大安全浓度;将选定浓度的青蒿素进行梯度稀释,采用先加病毒后加药物、先加药物后加病毒、中药和病毒同时作用的3种不同加药方式进行药物抗病毒试验,确定对病毒的最佳药物抑制浓度、预防浓度和杀灭浓度。应用实时荧光定量PCR法检测3种药物作用方式下BVDV的拷贝数,进一步明确药物对BVDV复制的作用。【结果】分子对接数据表明青蒿素与BVDV-NS5B存在相互作用,结合自由能为-28.6748 kJ/mol。青蒿素在MDBK细胞上的最佳药物安全浓度为100μmol/L。3种作用方式下青蒿素浓度为100μmol/L时均可有效影响BVDV的复制,青蒿素对BVDV的抑制作用最为明显。【结论】青蒿素可与BVDV-NS5B蛋白靶点互作,并能在MDBK细胞上有效抑制BVDV的复制,本研究为抗BVDV中药筛选奠定了基础。

基于小鼠模型研究肠道菌群紊乱对BVDV易感性的影响

本试验通过建立肠道菌群紊乱小鼠模型,旨在探究肠道菌群紊乱对BVDV易感性的影响。肠道菌群紊乱小鼠模型建立试验,共分为2组,采用两性霉素B、硫酸新霉素、氨苄西林、甲硝唑、盐酸万古霉素,以灌胃的方式构建肠道菌群紊乱小鼠模型,对照组给予等体积的生理盐水。连续处理13 d后,无菌收集小鼠粪便,提取细菌DNA,进行16S rRNA测序,检测小鼠肠道菌群多样性和丰度的变化。肠道菌群紊乱对BVDV易感性的影响试验,共分为2组,抗生素处理组和未处理组小鼠均接种10^(5) TCID_(50)的CP型BVDV,于感染第7天,采集小鼠血液和十二指肠,通过qRT-PCR、Western blot方法检测病毒载量。通过苏木精-伊红染色法(HE染色)检测十二指肠病理组织变化。粪菌移植(FMT)移植试验共分为2组,以灌胃等体积生理盐水组为对照,进一步验证恢复肠道菌群对BVDV感染的影响。结果显示,抗生素处理明显降低肠道菌群α多样性,维恩图分析也表明抗生素处理减少肠道菌群OTU数量。β多样性结合柱形图分析进一步表明,抗生素处理组与未处理组小鼠肠道菌群的组成存在明显差异,其中厚壁菌门和拟杆菌门的相对丰度在抗生素处理组中均显著降低,然而变形菌门相对丰度明显增加。对BVDV易感性探究发现,菌群紊乱小鼠血液和十二指肠中BVDV载量均显著高于BVDV感染的菌群正常组小鼠的BVDV载量。Western blot和病理组织学检测也发现,肠道菌群紊乱增加了小鼠十二指肠中BVDV E0蛋白表达水平,加重了十二指肠病理损伤。FMT回补给菌群紊乱小鼠后,BVDV载量显著降低,十二指肠病理变化也明显改善。综上,本研究成功建立肠道菌群紊乱小鼠模型,依据该模型进一步证实了肠道菌群紊乱可以增加BVDV的易感性,而FMT回补具有抑制BVDV感染的作用。这些结果可为防控BVDV感染的微生态制剂研发以及抗病毒药物的筛选奠定基础。

一例猫耳痒螨病的诊断及螨虫的分子鉴定

猫耳痒螨病是痒螨科耳痒螨属猫耳痒螨引起的高度接触性传染病寄生虫。主要寄生于猫和狗外耳道及临近皮肤,并引起强烈刺激,引起中耳炎,可分泌大量棕黑色耳垢([1])。耳部的瘙痒感可导致患病动物摩擦、抓挠自己的耳朵,并剧烈的摇头,严重时耳廓有血肿产生。由于猫耳痒螨的传染性强,能够感染接触到的动物甚至人类,且虫体抵抗力较强,能在6~8℃的畜舍内存活2个月左右,在-25℃时经6 h才死亡。

牛病毒性腹泻病毒E2蛋白与MDBK细胞互作蛋白的筛选

为了筛选与鉴定牛病毒性腹泻病毒(BVDV)E2蛋白与MDBK细胞的互作蛋白,以牛病毒性腹泻病毒BA株为模板,通过PCR扩增E2基因,构建重组质粒pFast-E2。将其转化至DH10Bac感受态细胞,再转染sf9昆虫细胞,获得P3代重组杆状病毒,在sf9细胞中表达E2蛋白,应用Western-blot进行鉴定,通过pull-down结合质谱技术筛选与鉴定BVDV E2蛋白与MDBK细胞互作的候选蛋白。结果表明,PCR克隆获得的E2基因片段大小约为1047 bp;在sf9昆虫细胞中能成功表达出分子质量约为43.6 ku的E2蛋白;筛选出8种候选互作蛋白,主要包括α-辅肌动蛋白(α-actinin)、延伸因子1-α(elongation factor 1-α)、波形蛋白(vimentin)和α葡萄糖苷酶Ⅱ(GANAB);通过GO分析可知,3种蛋白(P68103、E1B9F6、E1B7J1)具有GTP酶活性和结合GTP的功能,3种蛋白(A4ZZF8、Q3B7N2、P48616)具有结合双链RNA的功能,2种蛋白(Q3B7N2、A5D7D1)具有结合肌动蛋白丝的功能,2种蛋白(A4ZZF8、Q3B7N2)具有结合离子通道的功能和配体依赖性核受体转录共激活因子活性,2种蛋白(A5D7D1、A6QNJ8)具有结合m RNA的多聚腺苷酸尾部功能,1种蛋白(P48616)是细胞骨架的结构成分,且具有蛋白绑定功能。本研究为探索BVDV感染的分子机制以及治疗靶点筛选等研究提供了参考。

牛病毒性腹泻病毒N^(pro)基因克隆、生物信息学分析及其表达鉴定

目的研究牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea viruses,BVDV)N-端自身蛋白酶(N^(pro))的生物信息学特征及表达特性。方法克隆NADL株BVDV N^(pro)基因,利用生物信息学软件分析其编码蛋白的理化性质、疏水性、跨膜区、信号肽、二级及三级结构,并进行原核表达、纯化及鉴定。将纯化的重组N^(pro)蛋白免疫昆明小鼠,制备鼠抗N^(pro)蛋白多克隆抗体,采用ELISA法、间接免疫荧光试验及Western blot法进行多克隆抗体效价、特异性及蛋白反应原性检测。结果 PCR扩增的N^(pro)基因全长504 bp,编码168个氨基酸,N^(pro)基因与BVDV V026株属于同一分支。N^(pro)蛋白属于外膜蛋白,有亲水性,无信号肽,二级结构以β折叠和无规则卷曲为主。重组表达质粒pET-28a-N^(pro)经PCR及酶切鉴定正确,测序结果与原序列一致;表达的重组N^(pro)蛋白相对分子质量约25 000,纯化后纯度达95%以上,且免疫原性良好;制备的鼠抗N^(pro)蛋白多克隆抗体效价为1∶128 000,特异性良好。结论成功在大肠埃希菌中表达了BVDV N^(pro)蛋白,表达的N^(pro)蛋白免疫原性良好,为进一步研究BVDV N^(pro)蛋白的功能奠定了基础。

牛外周血淋巴细胞PD-1胞外区基因的原核表达及多抗制备

目的原核表达牛外周血淋巴细胞(peripheral blood lymphocytes,PBL)表面程序性细胞死亡蛋白-1(programmed cell death protein 1,PD-1),并制备其多抗血清。方法以PBL的cDNA为模板扩增牛PD-1胞外区片段,与载体pET-28a(+)连接,构建重组质粒pET-28a-PD-1,并进行生物信息学分析;重组质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3),经不同浓度的IPTG诱导表达牛PD-1胞外区重组蛋白(简称牛PD-1蛋白),产物进行SDS-PAGE及Western-blot分析;纯化的目的蛋白免疫小鼠制备血清多抗,与CP、NCP型牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)体外孵育牛PBL 72 h,检测BVDV病毒拷贝数。结果经双酶切及测序鉴定,重组质粒pET-28a-PD-1构建正确;牛PD-1胞外区基因读码框编码147个氨基酸,相对分子质量约为16040,其二级结构主要由α螺旋、延伸链、无规则卷曲构成,与人及鼠序列的同源性分别为79%和71%;在37℃,0.8 mmol/L IPTG诱导条件下,牛PD-1蛋白相对分子质量约19000,以包涵体的形式表达;制备的多抗血清效价最高为1∶102400,能与目的蛋白发生特异性反应,显著降低CP、NCP型BVDV病毒拷贝数(P<0.05)。结论成功构建了重组表达质粒pET-28a-PD-1,获得了牛PD-1蛋白及其多抗血清,且免疫原性较好,PD-1阻断抑制BVDV在PBL细胞中的复制,为开发具有调节及治疗慢性病毒感染的生物制品奠定基础。

牛源A型多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及毒力基因检测

为确定黑龙江省2个规模化奶牛场犊牛急性呼吸道感染的病因,笔者进行了病原的分离纯化,细菌16S rDNA基因和多杀性巴氏杆菌特异性基因OmpH鉴定、生化试验、药敏试验、半数致死量试验、荚膜血清型分型及22种毒力因子的检测,以确定主要病原的种类、型别及生物学特性。结果表明,从死亡牛肺和患病牛鼻拭子分离的2株病原菌均为荚膜A型多杀性巴氏杆菌,分别被命名为WC16551和LY01,序列分析结果表明,其与牛源多杀性巴氏杆菌同源性达到99%以上。药敏试验显示2株菌均对恩诺沙星、环丙沙星高度敏感。半数致死量结果表明,LY01菌株的毒力明显强于WC16551菌株,2株分离菌均携带19种毒力因子,未检出hgbB、toxA和nanB三种基因。上述研究结果表明,导致2个牛场发病的主要病原菌为荚膜A型多杀性巴氏杆菌。

小鼠感染BVDV诱导NLRP3炎症小体的表达及其对病毒复制的影响

为分析小鼠感染牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)诱导的NLRP3炎症小体表达情况及其对病毒复制的影响,选用40只4~6周龄雌性SPF级BALB/c小鼠,随机分成8组,其中BVDV接种小鼠7组,对照1组,每组5只。应用105 TCID50的CP型BVDV腹腔感染小鼠后,分别在感染后0、6、12、24、48、96、168和240h采集小鼠的肠道、脾脏和血液,通过qRT-PCR和Western Blot方法对小鼠十二指肠中NLRP3、IL-1β和Caspase-1分别进行基因及蛋白水平的检测。应用qRT-PCR方法确定不同时间点小鼠十二指肠和血液中的病毒载量,同时于感染后第168h检查十二指肠和脾脏病理组织变化。结果表明:1)小鼠感染BVDV早期(6、12和24h)组织中的NLRP3、IL-1β和Caspase-1基因转录水平逐步升高,48h未见明显变化,同时感染24h时,蛋白表达水平均显著高于对照组(P<0.05);2)小鼠感染BVDV后期(96、168和240h)NLRP3、IL-1β和Caspase-1的基因转录水平呈现下降趋势,168h时转录和蛋白水平降低最为显著(P<0.05);3)感染小鼠十二指肠、脾脏和血液的病毒载量均在168h达到高峰;第168h采集的小鼠十二指肠有大量炎性细胞浸润,脾脏淋巴细胞变性和坏死,证明BVDV感染模型成立。综上,NLRP3炎症小体在BVDV感染早期被激活,然而,随着病毒载量的增加,可能对其活性有一定的抑制作用。

牛METTL3真核表达载体的构建及生物信息学分析

[目的]对牛甲基转移酶METTL3基因进行真核表达并对其蛋白进行生物信息学分析。[方法]以MDBK细胞为模板,RT-PCR扩增牛METTL3基因片段,构建pcDNA3.0-METTL3载体并转染至293T细胞后,进行Western Blotting验证,通过生物信息学在线工具分析METTL3蛋白。[结果]PCR、双酶切鉴定、Western Blotting和生物信息学分析表明牛METTL3基因编码区序列全长为1760 bp,编码了580个氨基酸,蛋白的分子质量64.4469 kDa,PI为5.98,属于不稳定亲水性蛋白,不存在跨膜结构与信号肽。二级结构主要是由α螺旋和无规则卷曲构成,三级结构与二级结构预测结果一致。[结论]成功构建了pcDNA3.0-HA-METTL3真核表达载体,生物信息学分析表明,牛METTL3蛋白为在细胞质中分泌合成的可溶蛋白,α螺旋和无规则卷曲为二级结构中最主要的结构元件。