抗菌肽SMAP-29衍生物的原核表达及纯化

目的利用大肠杆菌表达系统表达具有抗菌活性的SMAP-29衍生物,一步亲和层析法进行纯化。方法化学合成经改造的抗菌肽SMAP-29衍生物,纸片扩散法检测抗菌活性后,人工并用合成抗菌肽SMAP-29衍生物基因序列,克隆到表达载体pTYB11上,转化大肠埃希菌BL-21(DE3),酶切和测序鉴定后,用异硫代β-D-半乳糖昔(isopropylβ-D-thiogalactoside IPTG)诱导表达融合蛋白。经几丁质亲和层析柱纯化。结果化学合成的抗菌肽SMAP-29衍生物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和绿脓杆菌具有一定的抑菌作用,SMAP-29衍生物的编码基因按正确方向和序列插入表达载体,融合蛋白的表达量达到大肠杆菌蛋白总量的40%,几丁质亲和层析后获得了可溶性SMAP-29衍生物。结论成功构建了以融合蛋白形式表达的抗菌肽SMAP-29衍生物大肠杆菌基因工程菌,克服了抗菌肽对宿主菌的毒性,实现了用大肠杆菌高效表达和一步亲和层析纯化,为进一步检测活性及临床应用奠定了基础。

理想的电生理学实验平台:急性分离的成年比格犬迷走神经节神经元

目的建立急性分离成年犬结状神经节神经元(VGN)电生理学研究平台。方法通过急性分离和培养雌雄成年比格犬VGN,利用全细胞膜片钳技术分别记录动作电位,电压依赖性的外向钾电流(IK)和超极化激活的阳离子电流(Ih)。结果动作电位波形分析结果显示:①雌性比格犬VGN不仅可以记录到传统分类中的髓鞘化A型和非髓鞘化C型神经元,还可以记录到雌性特异分布的Ah型神经元;②步阶电流除极在诱发相同持续放电频率时,A型所需要的刺激强度最小,Ah型所需要的电流强度与A型近似或轻微增加,而C型需要的刺激强度最大;③河豚毒素显著降低Ah型神经元的除极速率和触及阈值;蝎毒素可显著增加A-型的神经兴奋性;④所有受试神经元均表达IK和Ih,且2种电流密度均呈现A型>Ah型>C型;⑤尽管雌雄VGN分布的传入纤维种类有别,已知的A和C型VGN放电差异性并未在本研究中探讨。结论成年比格犬VGN可被成功急性分离,并用于动作电位、IK和Ih的记录;分类和电生理学特性足以完成药理学试验的需要,持续至少30 min的紧密封接应该满足药理学观察的需要。

抗人羧酸酯酶-Ⅱ单克隆抗体的制备与鉴定

目的制备鼠抗人羧酸酯酶-Ⅱ(humancarboxyles-terases-Ⅱ,hCE-Ⅱ)单克隆抗体(mAb)并对其特性进行鉴定。方法以含hCE-Ⅱ的人肝脏微粒体蛋白混合抗原免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备鼠抗hCE-Ⅱ的mAb,并用Protein-G亲和层析法纯化mAb。用间接ELISA法测定mAb的效价,以Westernblot鉴定mAb的特异性、免疫组化染色法对mAb相应的抗原进行组织定位。用免疫沉淀和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assistedlaserdesorption/ionizationtime-of-flightmassspectrometry,MALDI-TOF-MS)得到相应的肽质量指纹谱(peptidemassfingerprint,PMF),再通过Mascot在人类蛋白质数据库中分析比对鉴定mAb对应的抗原。结果获得1株可持续、稳定分泌抗hCE-Ⅱ的mAb的杂交瘤细胞系。杂交瘤细胞分泌的mAbIg的亚类(型)为IgG1(κ),腹水mAb的效价达1×10-7。Westernblot分析显示,在Mr为62000处有1条清晰的带。免疫组化染色显示,该mAb可与肝细胞的浆蛋白结合(hCE-Ⅱ存在于肝细胞浆内微粒体),而不与血管平滑肌细胞内的蛋白结合。该mAb免疫沉淀物的Mr为62000,与hCE-Ⅱ的Mr相符。对免疫沉淀的蛋白质进行质谱鉴定证实,该mAb对应的抗原为hCE-Ⅱ。结论制备出的鼠抗hCE-Ⅱ的mAb效价高、特异性良好,为进一步研究hCE-Ⅱ的功能及其在肝癌等癌症的诊断和治疗中的作用提供了工具。

PUMA-BH3结构域短肽的原核表达、纯化及促凋亡活性鉴定

Bcl-2家族蛋白质在线粒体途径凋亡的调控机制中起着重要的作用,p53正向细胞凋亡调控因子(p53 up-regulated modulator of apoptosis protein,PUMA)是该家族的一种只含有BH3同源区域的促凋亡蛋白。为得到PUMA的BH3结构域短肽并检测其生物学活性,将人工合成的编码PUMA-BH3肽的DNA片段克隆到质粒pTYB2上,构建出表达PUMA-BH3-内含肽-几丁质结合域融合蛋白的原核表达载体pTYB2-PUMA-BH3,转化大肠杆菌BL-21(DE3)中IPTG诱导表达。表达的融合蛋白经几丁质亲和层析、二硫苏糖醇(DTT)的柱内还原,直接获得可溶性PUMA-BH3肽。通过研究重组PUMA-BH3肽在体外条件下对线粒体活力、线粒体肿胀度以及细胞色素c释放的影响来鉴定其生物学活性。结果表明,获得的可溶性PUMA-BH3肽能作用于离体线粒体,引起线粒体活力降低,线粒体肿胀并能诱导细胞色素c释放。环孢菌素A对此有一定的抑制作用,提示PUMA-BH3肽对线粒体的上述作用是通过促进通透性转运孔(PTP)开放实现的。经原核表达及纯化,获得了具有促凋亡活性的PUMA-BH3肽,为进一步研制控制凋亡过程的药物奠定了基础。

15-脂氧化酶及其m RNA在局灶性脑缺血预处理大鼠中作用机制的探讨

目的 观察局灶性脑缺血预处理对大鼠脑 15 -脂氧化酶 (15 - L O)表达及其 m RNA(15 - L O m RNA)转录的影响 ,探讨两者在诱导脑缺血耐受中的意义。方法 线栓法制备大鼠局灶性脑预缺血 -缺血再灌注模型 (PC-MCAO)及局灶性单纯脑缺血再灌注模型 (MCAO) ,各组于不同时程用免疫组化法检测 15 - L O的表达、原位杂交法检测 15 - L O m RNA的表达。结果 PC- MCAO组较对应时程的 MCAO组 15 - L O m RNA及其蛋白 15 - L O的表达强度显著降低 (P<0 .0 5 )。结论 脑预缺血处理可致 15 - L O及其基因表达下调 ,这可能是局灶性脑缺血预处理诱导脑缺血耐受的机制之一。

抗人羧酸酯酶-Ⅱ多克隆抗体的制备、鉴定及应用

目的:构建人羧酸酯酶-Ⅱ(hCE-Ⅱ)原核表达质粒并在大肠杆菌中表达,制备多克隆抗体(pAb),并对其特性进行初步鉴定。方法:以人正常肝cDNA文库为模板,构建重组表达质粒pGEX-4T-1-hCE-Ⅱ(即hCE-Ⅱ-GST)和pET-32a-hCE-Ⅱ(即hCE-Ⅱ-His)。在宿主菌BL21内进行诱导表达,hCE-Ⅱ-GST融合蛋白作为免疫原免疫大耳白兔,用辛酸-硫酸铵分步沉淀法初步纯化抗血清,并用间接ELISA、West-ernblot及免疫组化检测抗体的灵敏度和特异性。结果:成功制备了抗hCE-Ⅱ的多克隆抗体。Westernblot鉴定表明该抗体可特异性识别重组蛋白以及天然的人肝微粒体蛋白。免疫组织化学鉴定显示该抗体可特异性结合肝包浆中的hCE-Ⅱ蛋白,而不与血管平滑肌细胞结合。结论:制备的pAb有较高的效价和较好的特异性,为肝癌诊断试剂盒的研究奠定了实验基础。

两个改造后的肿瘤抑素抗肿瘤活性肽活性研究

为了研究改造后的肿瘤抑素2个抗肿瘤活性肽的作用机制,明确其不同的抗肿瘤活性,采用基因工程技术原理,人工合成肿瘤抑素中185～203位氨基酸所对应的19肽和T7肽(74～98位氨基酸)基础上改造的21肽碱基序列,将其与融合蛋白表达载体pTYB2重组后转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,用几丁质亲和层析柱一步纯化,直接获得19肽和21肽,利用MTT法、细胞生长曲线、TUNEL法、流式细胞仪早期细胞凋亡检测和细胞周期检测,小鼠H22腹水型转移型肝癌实体瘤抑瘤实验并结合组织病理学切片,来研究19肽和21肽单独应用或联合应用对肿瘤细胞和内皮细胞生长和凋亡的影响以及对体内肿瘤的抑制情况.体内外实验表明:获得的19肽抗肿瘤活性以直接作用肿瘤细胞为主,也有抑制新生血管生成的作用.基因重组21肽抗肿瘤作用是通过抑制肿瘤组织新生血管生成实现的.19肽、21肽联合应用对肿瘤细胞、内皮细胞生长抑制和促凋亡作用明显增强,抗肿瘤活性大大提高.联合用药弥补了单独用药不足,产生协同抗肿瘤作用,可能会成为今后肿瘤治疗的一个主要方向.

肿瘤抑素抗肿瘤相关肽对肝癌细胞增殖和凋亡的影响

肿瘤抑素抗肿瘤相关肽-19肽是由肿瘤抑素185～203住氨基酸组成,具有直接抑制黑色素瘤细胞生长作用,但其对肝癌细胞增殖和凋亡是否有影响,对肝癌是否具有治疗作用还需进一步研究。本研究中采用基因工程技术将合成19肽基因与载体pTYB2重组后进行蛋白表达、纯化获得19肽。通过MTT法、生长曲线观察19肽对人肝癌细胞生长抑制作用;TUNEL标记法、流式细胞仪细胞周期检测法、透射电镜观察19肽对肝癌细胞凋亡的影响:小鼠H22腹水型转移型肝癌实体瘤抑瘤实验证明其体内的抑瘤作用。MTT实验和生长曲线实验表明随着19肽浓度的增加肝癌细胞的存活率下降。在相同19肽浓度下,随着作用时间延长存活细胞逐渐减少。电镜观察治疗组细胞出现明显凋亡,流式细胞仪可检测到前G1峰,TUNEL标记法也证实治疗组可见明显的凋亡细胞,体内19肽作用的小鼠H22腹水型转移型肝癌的抑瘤率达48.46%。可见,肿瘤抑素19肽可抑制肝癌细胞生长,促进肝癌细胞凋亡,对肝癌具有一定的治疗作用。

肿瘤抑素抗血管活性相关肽对宫颈癌Hela细胞生长和转移抑制作用的实验研究

目的研究改造后的血管生成抑制相关肽(21肽)抗血管生成活性及对人宫颈癌Hela细胞皮下移植裸鼠模型的抑制作用,探讨其抑瘤作用机制。方法2005年8月至2006年2月哈尔滨医科大学第一临床医学院进行Hela细胞株皮下接种裸鼠造模,21肽治疗3周后,处死动物剥离肿瘤,称重并计算抑瘤率。免疫组化方法检测21肽对肿瘤组织的微血管密度(MVD)、增殖细胞核抗原(PCNA)和血管内皮生长因子(VEGF)的影响。结果21肽组平均抑瘤率可达51.89%,肿瘤组织微血管密度明显降低,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05);21肽组肿瘤组织的PCNA、VEGF呈低表达,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论21肽具有显著的抗血管生成活性,可明显地抑制裸鼠宫颈癌细胞的生长,其抑制宫颈癌的作用机制可能与其降低新生血管形成和调解血管生成相关因子的表达有关。

兔抗人细胞色素P450 1A2多克隆抗体的制备及鉴定

目的：制备兔抗人细胞色素P4501A2（CYP1A2）抗体及其特性鉴定。方法：利用生物信息学方法分析CYP1A2蛋白的序列，根据亲水性、抗原性、柔韧性及表面性等指标选择多肽序列，合成CYP1A2多肽，与载体蛋白钥孔戚血蓝素（Keyhole limpet hemocyanin，KLH）偶联，免疫日本大耳白兔制备抗CYP1A2抗体。辛酸-硫酸铵法纯化抗体，间接ELISA法测定抗体的效价及相对亲和力常数，Western blot鉴定其特异性，免疫组化进行定位。结果：获得针对小分子CYP1A2的抗体。该抗体效价为1∶16000；相对亲和力常数在10^5-10^6/M，具有实用价值；可与CYP1A2合成肽及天然CYP1A2出现特异性反应；可识别正常人肝脏组织CYP1A2；Western blot的结果显示，该抗体识别的相应抗原的相对分子质量为58000。结论：合成的多肽-KLH复合物具有免疫原性，可用于制备相应的抗体。制备的兔抗CYP1A2合成肽抗体可应用于酶联免疫吸附试验、免疫印迹、免疫组化实验。

mdr1基因转染的CIK细胞耐药性及杀伤活性的研究

目的:将多药耐药基因(mdr1)转入CIK细胞,观察转染前后其对紫杉醇的耐药性及对Lewis肺癌细胞杀伤活性的影响。方法:常规方法:培养CIK细胞,在细胞对数生长期,将mdr1的重组质粒转染CIK,通过RT-PCR鉴定耐药基因表达;MTT法检测CIK细胞对紫杉醇敏感性的变化,同时检测转染前后CIK细胞对Lewis肺癌细胞的杀伤活性变化;Western blot检测细胞中mdr1编码的P-gp蛋白的表达的变化;通过计算瘤重抑制率(TWI)检测转染前后的CIK细胞对Lewis肺癌移植瘤的抑制作用。结果:转染mdr1后的CIK细胞mdr1 mRNA阳性,同时P-gp的表达较转染前及转染空质粒的CIK细胞均有显著增高(P<0.05),转染后的CIK细胞对紫杉醇的耐药性有显著提高,但对Lewis肺癌细胞的杀伤活性无明显变化(P>0.05)。结论:将mdr1基因转入CIK细胞后,细胞获得了多药耐药性,同时保持了原有的对肿瘤细胞的杀伤活性。

鼠抗人CD20单克隆抗体的制备与鉴定

目的:制备CD20融合蛋白及制备CD20的单克隆抗体(mAb),并对其进行特性鉴定。方法:以人单核细胞cD-NA文库为模板,构建重组表达质粒pGEX-4T-1-CD20(即CD20-GST)和pET-32a-CD20(即CD20-His)。以融合蛋白CD20-GST为免疫源免疫BALB/c雌性小鼠制备(mAb),用间接ELISA法测定抗体的效价,Western blot、免疫荧光鉴定其特异性及免疫组化染色法对mAb相应的抗原进行组织定位。结果:CD20-GST和CD20-His蛋白在大肠杆菌中可高效表达,经纯化后可获得高纯度的CD20蛋白,经细胞融合得到1株稳定分泌CD20抗体的杂交瘤细胞株,Western blot和免疫组化显示抗CD20mAb与CD20蛋白具有良好的反应性。结论:成功制备高纯度CD20蛋白并以此为抗原制备了1株能够稳定分泌抗人CD20的鼠mAb的杂交瘤细胞株BD11F4,为进一步研究CD20对非霍奇金淋巴瘤的诊断治疗提供基础。

长链非编码RNA在心律失常中的作用研究进展

长链非编码RNA(lncRNA)在心律失常中具有重要作用。lncRNA通过影响心脏电重构、结构重构、能量代谢障碍及自主神经重构等机制参与房颤的发生,通过调节离子通道编码基因诱发长QT间期综合征,通过改变心脏传导影响心肌肥厚/心力衰竭诱导的心律失常等。本文综述上述研究进展,以期为心律失常的研究和治疗提供新思路。

Piezo通道的功能及其药理学研究进展

自被发现以来,机械敏感性离子通道受国内外学者广泛关注,尤其是近年来发现的Piezo通道,对哺乳动物的机械信号转导至关重要。该通道分布广泛,参与机体多种生理和病理过程。新近研究表明,Piezo通道参与细胞增殖、分化和迁移及触觉感知、血压的自发调节等过程,也与非小细胞肺癌等疾病的发生有关,而药物可通过Piezo通道干预生理和病理进程。本文主要综述Piezo通道的功能及与之相关的药理学研究进展,为靶向药物的开发提供借鉴。

血压神经调控性别差异的关键:Ah型髓鞘化压力感受器神经元

大量基础与临床的统计学结果表明,无论是正常血压还是高血压的发病率,成年男性均明显高于同龄女性,这种性别差异在绝经期后消失。我们经过近20年的研究发现,成年雌性大鼠结状神经节及孤束核中不仅分布有传统分类的髓鞘化A型和非髓鞘化C型内脏感觉/压力感受器神经元以外,还特异性分布一种髓鞘化Ah型神经元,它的电生理学特性、化学敏感性以及离子通道表达均与A型和C型有所不同。在体和离体研究结果显示,Ah型神经元具有以下功能特征:①仅分布于成年雌性大鼠,神经兴奋性依赖于雌激素的存在;②属于髓鞘化纤维,传导速度室温下2~20 m·s^-1,但动作电位复极期有类似于C型驼峰切记;③动作电位除极阈值、除极速度、动作电位时程以及放电频率均不同于A和C型;④同为髓鞘化纤维,Ah型对神经递质和血管活性物质敏感;⑤虽表现有除极期驼峰,Ah型对辣椒素不敏感,同工凝集素B4表达阴性;⑥Ah型功能性表达Nav1.7,Nav1.8和Nav1.9;⑦Ah型对血管紧张素Ⅱ高度敏感,并高表达血管紧张素Ⅱ型受体,参与降压作用;⑧Ah型对血清素高度敏感,可能与其高表达血清素Ⅲ型受体有关,下行抑制心脏疼痛感受,参与无痛心绞痛的发病过程;⑨Ah型对组胺高度敏感,并高表达组胺Ⅱ型受体,与哮喘发病的性别差异密切相关。综上所述,成年雌性大鼠髓鞘化Ah型内脏感觉神经元/压力感受器神经元,独立存在并不同于A和C型,是构成与内脏感觉/主动脉压力反射传入通路性别差异相关生理功能的神经解剖学基础,为合理解释上述相关病理生理机制揭开了新的一页。

三氧化二砷对组织纤维化的作用及机制研究进展

砷是一种在自然环境中广泛分布的金属,长期接触可导致在人体内蓄积中毒。同时,三氧化二砷也是重要的抗肿瘤药物,对急性早幼粒细胞性白血病和肝癌等均有显著治疗作用,但其治疗过程中也会引起心、肝和肾等组织的不良反应。纤维化是一种病理性瘢痕形成过程,严重时会导致器官结构和功能受损。近年来研究表明,砷与组织纤维化密切相关。本文总结三氧化二砷对不同器官(包括心、肝、肺和肾等)纤维化的作用和机制,分析三氧化二砷不同给药时间、给药剂量及给药方式对纤维化的影响,发现三氧化二砷能诱导心、肝及血管纤维化,而在肺、肾及皮肤组织则表现出剂量相关的双向调节作用。介绍非编码RNA介导三氧化二砷作用机制的进展,这些新发现提示长非编码RNA和环状RNA可能是三氧化二砷诱导纤维化的潜在重要机制。本综述旨在为三氧化二砷的临床合理用药和毒性预防提供新思路。

丹参酮ⅡA调节microRNA-1保护缺氧心肌细胞的作用研究

目的:研究丹参酮Ⅱ A(TanshinoneⅡA)通过调节microRNA-1抗心肌细胞缺氧损伤的作用。方法:原代培养新生大鼠心肌细胞,建立心肌细胞缺氧模型。MTT法检测心肌细胞存活率(%);TUNEL、流式细胞术测心肌细胞凋亡率;激光共聚焦检测心肌细胞内钙离子[Ca2+]i浓度的变化情况。结果:MTT结果显示丹参酮ⅡA对缺氧心肌细胞及过表达miR-1引起心肌细胞损伤具有保护作用。丹参酮ⅡA增加了缺氧心肌细胞的存活率(P<0.05),同时给予丹参酮ⅡA和miR-1组与单独miR-1损伤组相比较,存活率也明显升高,呈现剂量依赖性。TUNEL结果显示丹参酮ⅡA可以抑制缺氧诱导的细胞凋亡,丹参酮ⅡA可以明显降低由缺氧导致的细胞凋亡率(P<0.05)。共聚焦检测结果显示,缺氧损伤的心肌细胞内[Ca2+]i显著升高1322.72±5.16(vs正常对照组,P<0.05),丹参酮ⅡA则有效抑制由缺氧引起过高的[Ca2+]i。miR-1诱导的细胞内[Ca2+]i升高至1349.33±62.63,约为正常对照组的1.96倍,而丹参酮ⅡA则有效抑制胞内过高的[Ca2+]i,从而发挥心肌保护作用。结论:丹参酮ⅡA可能是通过抑制胞内miR-1的表达,参与对钙离子浓度的调控,发挥其对心肌细胞的保护作用。

丝氨酸蛋白酶抑制剂PN-1的研究进展

丝氨酸蛋白酶抑制剂PN-1,由SERPINE2基因编码,是丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族中的一员,是由多种细胞分泌的单链糖蛋白。PN-1在血浆中表达很少,但在多种器官和细胞类型中均有发现,在许多生物事件中发挥着重要的调节作用。PN-1在血液凝结、免疫反应、纤溶、血管发生、炎症和肿瘤抑制等一系列生理病理过程中发挥着重要作用。近年来对PN-1的研究,日益受到人们的关注,本文将主要综述PN-1在循环系统、肿瘤、神经系统以及肺部相关疾病中的最新研究进展及作用。

三氧化二砷新剂型的研究进展

三氧化二砷是急性早幼粒细胞白血病的一线用药,对多种实体瘤也具有抑制作用。然而,三氧化二砷肾脏清除速率快,无组织特异性分布,靶向性较差,易产生心、肝和肾等毒性作用,限制了其在实体瘤的临床应用。近年来,科学家开发大量三氧化二砷新剂型以提高其疗效,降低其不良反应,包括脂质体、微球、纳米粒、乳剂和悬浮剂等。本文对三氧化二砷的新剂型研究进展进行梳理,以期为三氧化二砷新剂型的合理开发和应用提供新思路。

SERPINE家族在纤维化疾病中作用的研究进展

丝氨酸蛋白酶抑制剂(Serine Protease Inhibitor,Serpin)是一类丝氨酸蛋白酶活性调节剂,在人体中被分为A^I9个亚家族,其中SERPINE(Serpin Peptidase Inhibitor,Clade E)家族参与调节生物体内多个重要的生命过程。本文通过介绍SERPINE家族中两个重要成员SERPINE1与SERPINE2的理化性质、作用机制以及调控因素,阐述SERPINE家族在纤维化相关疾病中的作用及研究进展。