猪粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的表达及其促淋巴细胞增殖活性测定

根据GenBank上公布的猪粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(pGM-CSF)基因序列(U67175.1)扩增该基因,克隆至pET30b载体,构建重组表达载体pET30b-pGM-CSF,并与分子伴侣辅助质粒pG-KJE8共同转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导后,通过SDS-PAGE分析,可见表达的目的蛋白大小约为23ku,主要以包涵体形式存在,且在分子伴侣的辅助下,增大了可溶性蛋白的表达量。经镍离子亲和层析纯化后,通过淋巴细胞增殖试验初步检测了pGM-CSF蛋白促进淋巴细胞增殖的活性。结果表明,猪GM-CSF具有明显的体外刺激淋巴细胞增殖的生物学活性,为进一步研究猪GM-CSF的生物学功能以及临床应用奠定了基础。

β-淀粉样蛋白对原代培养大鼠海马神经细胞钙稳态和线粒体线粒体通透性转运孔道的影响

目的研究β-淀粉样蛋白（β-amyloid）对原代培养的大鼠脑海马神经细胞内钙稳态和线粒体通透性转运孔（mltoehortrial permebility transitionpore，MPTP）的影响，探讨其神经毒性作用的机制。方法原代培养8d后的Wistar大鼠脑海马神经细胞，用老化的Aβ25-35，对其进行1，10和20μmol／L剂量的染毒，培养24和48h后观察海马神经细胞形态、游离钙浓度、Ca^2＋-ATP酶活性、线粒体膜电位，应用Western blot方法分析MPTP组成蛋白表达情况。结果随着Aβ25-35剂量的增加和染毒时间的延长，可以观察到原代培养的海马神经细胞呈现出弥漫性肿胀、开始变形、出现空泡、胞体边缘模糊的形态变化；原代培养海马神经细胞内的游离钙离子的浓度也呈逐渐上升趋势，其中Aβ25-35 20μmol／L组在24h和48h时，细胞内钙离子浓度分别为（31．04±4．16）和（32．80±0．43），均显著高于对照组（20．95±4．04）和（22．23±0．49）（P〈0．05）；Ca2＋-ATP酶活性随着染毒剂量和染毒时间增加明显降低（P〈0．05），其中Aβ25-3520μmol／L组在24h和48h时，细胞内Ca2＋ATP酶活性为（2．14±0．01）和（1．10±0．05）U／mgprol，均显著低于对照组（5．17±0．08）和（4．57±0．06）（P〈0．05）；线粒体膜电位Aβ25-3520μmol／L组在24h和48h时，细胞内线粒体膜电位分别为（20．34±7．05）和（19．05±6．15），均显著低于对照组（38．47±0．72）和（40．07±1．26）（P〈0．05）；有明显剂量反应关系；MPTP孔道蛋白的WB结果显示蛋白表达量随着染毒剂量增加而增加。结论Aβ25-35,通过破坏细胞的钙稳态激活MPTP孔道影响线粒体功能从而发挥神经毒性作用。

β-淀粉样蛋白对原代培养大鼠海马神经细胞Sorcin、RyR2mRNA基因表达的影响

目的研究β-淀粉样蛋白（Aβ）对原代培养的大鼠脑海马神经细胞内钙稳态相关蛋白Sorcin、RyR2mRNA的影响。方法新生1-3天的Wistar大鼠，取其海马组织，原代培养8d后，用已老化过的Aβ25-35对海马神经细胞进行1μmol／L，10μmol／L和20μmol／L剂量的染毒，培养24和48h后分别观察海马神经细胞形态、和海马神经细胞内钙调节相关蛋白Sorcin、RyR2mRNA的基因表达水平。结果随着Aβ25-35剂量的增加和染毒时间的延长，可发现随着Aβ25-35剂量的增加和染毒时间的延长，海马细胞出现细胞凋亡的比例增加，其中Aβ25-35 20μmol／L染毒48h培养海马细胞中出现了大量早期凋亡细胞和少量中期凋亡细胞。实时定量PCR结果显示，10μLmol／LAβ25-35在对原代细胞染毒24和48h后SorcinmRNA的相对表达量为（1．42±0．03）和（1．63±0．02），与对照组相比，表达增加（P〈0．05）；20μmol／L Aβ25-35在对原代细胞染毒24h和48h后SorcinmRNA的相对表达量（2．11±0．05）和（2．23±0．05），与对照组相比，表达增加（P〈0．05）；20μmol／L Aβ25-35在对原代细胞染毒24和48h后RyR2mRNA的相对表达量为（1．64±0．03）和（1．95±0．03），表达显著高于对照组相（P〈0．05）。结论Aβ具有神经毒性，可抑制海马神经细胞的生长，可通过作用于钙调节相关蛋白的表达，诱发阿尔茨海默氏病（AD）的发生。

三聚氰胺单独及与三聚氰酸联合染毒致大鼠的肾毒性

目的探讨三聚氰胺单独及与三聚氰酸联合染毒致大鼠的肾毒性。方法将初断乳清洁级雄性Wistar大鼠36只按体重随机分为3组,分别为三聚氰胺(25mg/kg)+三聚氰酸(25mg/kg)染毒组、三聚氰胺(25mg/kg)染毒组和对照组,每组12只。采用饲料掺入法进行染毒,连续染毒4周。染毒后,处死动物,取血清测定肌酐、尿素氮、甘油三酯,取肾脏称重并计算脏器系数,观察肾脏的形态学和组织病理学变化。采用X射线衍射仪对肾脏中的晶体进行定性,采用液相色谱-质谱联用法测定三聚氰胺和三聚氰酸的含量。结果两染毒组大鼠均出现食欲减低,多尿,少动,体重下降(P<0.01),肾脏系数升高(P<0.01)。与对照组比较,三聚氰胺染毒组以及三聚氰胺+三聚氰酸染毒组血清中尿素氮、肌酐和甘油三酯含量均升高,差异有统计学意义(P<0.01)。肉眼观察可见,三聚氰胺+三聚氰酸染毒组和三聚氰胺染毒组肾脏肿胀明显,体积增大,呈土黄色沙石样外观;组织病理学检查可见,肾小管中存在大量晶体,肾小管上皮受损。X射线衍射法确认肾脏中含有三聚氰胺-三聚氰酸晶体。三聚氰胺+三聚氰酸染毒组和三聚氰胺染毒组肾组织中三聚氰胺、三聚氰酸含量间比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论单独给予一定量的三聚氰胺及同时给予三聚氰酸均可在大鼠肾脏形成晶体,造成不同程度的肾小管继发性损伤,并最终导致肾功能衰竭,三聚氰胺+三聚氰酸染毒组肾功能和组织病理学改变更为严重。

三聚氰胺致大鼠肾损伤及恢复期的变化

目的探讨三聚氰胺致大鼠肾损伤后停止染毒,肾损伤的自然恢复情况。方法将40只健康清洁级Wistar雄性大鼠随机分为三聚氰胺染毒组(25 mg/kg)和对照组,每组20只。采用饲料掺入法进行染毒,连续染毒4周。分别于染毒4周末和恢复2、6、12周末,测定血清测定尿素氮、肌酐含量,并观察肾组织的病理学改变。结果与对照组比较,染毒4周及恢复2、6周时染毒组大鼠血清尿素氮、肌酐水平显著升高,差异均有统计学意义(P<0.01);而恢复12周时染毒组大鼠血清尿素氮、肌酐水平无显著改变。肉眼观察可见,染毒组大鼠肾脏体积增大,外观呈特征性土黄色沙石样;肾组织少见毛细血管网,弥漫性分布的点片状结晶体阴影;肾小管、肾盂中存在大量结晶体,肾小管上皮坏死脱落。恢复12周后,肾脏呈暗红色,表面凸凹不平;肾组织再生修复。结论三聚氰胺染毒可对大鼠肾组织造成损伤;停止染毒后不给予任何药物干预,损伤的肾组织能够自然修复再生,肾功能基本恢复正常。