胶体金免疫层析法床旁快速检测烧伤创面铜绿假单胞菌的效果

目的 与传统细菌培养法相比较,探讨胶体金免疫层析（GICA）法检测烧伤创面铜绿假单胞菌（PA）的可行性. 方法 2012年1-12月,采集齐齐哈尔医学院附属第三医院烧伤科收治的96例烧伤患者创面分泌物,应用传统细菌培养法鉴定为31例阳性（31株PA）、65例阴性.（1）将2株杂交瘤细胞分别接种于5只BALB/c小鼠腹腔制备抗OprH单克隆抗体,斑点印迹法检测抗体特异性,ELISA法检测抗体型别,间接ELISA法检测抗体效价,菲竞争ELISA法检测抗体亲和力.（2）取1株判定为AmpC β内酰胺酶（简称AmpC酶）阳性的PA,提取酶提取物,单独或与弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂免疫10只BALB/c小鼠制备抗AmpC酶多克隆抗体,间接ELISA法测定抗体效价.（3）制作GICA试纸条.用1 mL胶体金（1 mg/mL）分别标记20 μg抗OprH单克隆抗体、抗AmpC酶多克隆抗体,将二者喷涂于玻璃纤维膜上并划于硝酸纤维素膜上,将1.5 mg/mL羊抗鼠IgG划于距OprH检测线1 cm处.取传统细菌培养法鉴定的31株PA及金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、鲍氏不动杆菌、奇异变形杆菌标准菌株各1株,检测试纸条特异性;采用1×105、5×105、1×106、1 ×107、1×108 CFU/mL PA标准菌株检测试纸条敏感性;将试纸条在4、37℃分别存放10、20、30 d后,观察其检测浓度为1×106、1 ×107、1×108 CFU/mL的PA标准菌株的稳定性.（4）用GICA试纸条检测96例患者临床样本,计算与传统细菌培养法鉴定PA结果的阳性符合率. 结果 （1）制备的抗体与PA重组外膜蛋白OprH有较好的结合性,经鉴定确认为抗OprH单克隆抗体.2株杂交瘤细胞分泌的抗OprH单克隆抗体均为IgG2a亚类,效价分别为1∶2.02×106、1∶1.83×10 7,亲和常数值分别为7.3×107、3.6×108.（2）抗AmpC酶多克隆抗体效价为1∶3.05×106.（3）经GICA试纸条检测,31株传统细菌培养法鉴定的PA中29株阳性、2株阴性,AmpC酶为阴性;金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、鲍氏不动杆菌、奇异变形杆菌均为PA、AmpC酶阴性.PA标准菌株浓度为1×106、1×107、1×108 CFU/mL时,为PA阳性、AmpC酶阴性;PA标准菌株浓度为5×105 CFU/mL时,为PA弱阳性、AmpC酶阴性;PA标准菌株浓度为1×105 CFU/mL时,为PA、AmpC酶阴性.除37℃放置30 d的GICA试纸条检测1 × 106 CFU/mL的PA标准菌株结果为弱阳性外,4、37℃放置各时相点GICA试纸条对1×106、1×107、1×108 CFU/mL的PA标准菌株检测结果均为阳性;AmpC酶均为阴性.（4）GICA试纸条与传统细菌培养法鉴定PA的阳性符合率为93.55％ （29/31）. 结论 GICA法检测PA的灵敏度高、特异性好、需时短,且可鉴定其是否产AmpC酶.