福建省谱系3 PRRSV的分离及其ORF5基因序列分析

对福建省新流行谱系3的PRRSV进行分离,并对其分子生物学特性进行初步研究,为新流行毒株的防治提供依据和参考。分离的毒株通过RT-PCR和IFA对PRRSV分离毒株进行鉴定,并对其ORF5基因进行序列测定分析。结果显示,分离株能够在Marc-145细胞上增殖并产生典型的细胞病变,被抗PRRSV的特异性单克隆抗体所识别,具有特异性免疫荧光,其TCID50为105.3,将其命名为FJFQ1805。分离株ORF5基因与北美型PRRSV参考株核苷酸同源性为83.9%~92.2%,与谱系3病毒株QYYZ的同源性最高,为92.2%。系统进化树分析表明,该分离株属于北美型,与QYYZ、GM2和FJFS等谱系3的病毒株属于同一分支。综上,所分离的FJFQ1805毒株为谱系3的病毒株。

福建省14株PRRSV-2全基因组特性分析

为了解福建省PRRSV的流行情况及分子特征,本研究选取14株不同年份不同谱系的PRRSV-2(lineage 3、lineage 8.7、lineage 5.1和lineage 1)进行全基因组扩增并测序分析。结果显示,福建省14株PRRSV-2基因组全长为15 016 bp^15 407 bp,与VR-2332、CH-1a、JXA1和NADC30的核苷酸序列同源性为82.9%~99.4%,14株PRRSV-2之间核苷酸序列同源性为82.1%~99.3%,差异较大。分离株FJCH、FJZH与JXA1-R疫苗株高度同源(99.5%~99.6%),且处于同一进化分支,推测其可能来源于疫苗株。重组分析显示14株PRRSV-2存在较高的重组概率(3/14),均发生在lineage 8.7和lineage 1之间。本研究为科学防控福建地区PRRS提供了参考数据。

福建省某规模化猪场种公猪精液PRRSV检测及ORF7基因序列分析

为了解福建省某规模化猪场种公猪猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的流行情况和流行特点。按照10%比例随机采集该场种公猪精液样本17份,通过RT-PCR方法对其进行PRRSV检测及ORF 7基因序列分析。结果表明,9份精液PRRSV呈阳性,样品阳性率为52.7%;遗传进化树分析表明,该猪场PRRSV ORF 7基因与QYYZ、GM2、FJFS等谱系3毒株亲缘关系较近,处于同一进化分支,而与VR2332、CH-1a、NADC30、JXA1和HuN4等亲缘关系较远,处于不同的进化分支,表明该毒株为近期新流行的谱系3的毒株。

2009─2017年福建省猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学调查和遗传变异分析

为了了解福建省猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）流行动态和遗传变异特性,应用RT-PCR方法对福建省龙岩市、漳州市、厦门市、福州市、三明市、莆田市和宁德市等七市的102个不同规模的猪场开展了PRRSV病原学调查。基于ORF5基因的系统进化分析表明,福建省Type 2 PRRSV可分为lineage 1、lineage 3、lineage 5.1和lineage 8.7四个谱系,其中lineage 1（NADC30-like PRRSV）和lineage 3是福建省新出现的毒株。2009—2013年福建省以lineage 8.7的毒株为主,2014—2017年流行毒株发生了转变,以NADC30-like PRRSV为主。PRRSV GP5中和表位发生较高程度的变异,N-糖基化位点增多并逐步靠近下游的中和表位。结果表明,福建省PRRSV呈现复杂多样性,猪场防控PRRS应该采取综合防控措施,避免引入新毒株。

利用DNA Shuffling技术构建重组PRRSV ORF5基因

通过DNA shuffling技术对PRRSV ORF5基因进行改组,研究其对异源毒株交叉中和能力。将获得的嵌合基因△2ORF5与载体pET-32a连接,转化到大肠杆菌Escherichia coli BL21中,经诱导表达获得约42 kDa重组蛋白。将纯化的重组△2ORF5蛋白免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体,Western blotting试验表明其与4株亲本毒株重组ORF5蛋白具有良好的反应性。病毒感染抑制试验结果表明,多克隆抗体对4株亲本毒株具有较高的抑制率(>53%)。研究结果为研制新型PRRSV疫苗奠定了基础。

伪狂犬病病毒变异株Fujian-LY对生长育肥猪的致病性研究

将6头80日龄伪狂犬病病毒(PRV) g B、g E抗体均为阴性的生长育肥猪随机分成对照组和感染组,每组3头。感染组试验猪通过颈部肌肉接种Fujian-LY株2m L,对照组猪经相同途径接种等体积的DMEM,每日观察记录试验猪的发病及死亡情况,试验期为7 d。结果显示,感染组育肥猪临床症状表现明显,在感染1 d后体温均开始升高,随着病情的发展,表现咳嗽、喘气、流鼻涕等典型的呼吸道症状,至试验结束未出现死亡。病理剖检显示,与对照组相比,感染育肥猪除脑部病变明显外,心、肝、脾、肺、肾等主要器官组织均未出现明显的肉眼可见病变。组织病理学检查结果显示,PRV Fujian-LY株已对感染育肥猪的多个主要器官组织造成了较为严重的病理损伤:脑实质中小血管扩张充血,血管周围有淋巴细胞包围的"血管套"现象;肝索紊乱、肝细胞坏死;免疫器官中淋巴细胞减少等。同时采用PCR及免疫组织化学方法对这些组织进行检测均呈PRV阳性。g B、g E抗体检测结果显示,感染猪在感染后第7天PRV g B、g E抗体均开始转阳。上述结果表明,PRV Fujian-LY株对生长育肥猪具有较强的致病性,在发病猪体内分布广泛。

变异猪伪狂犬病病毒自然感染仔猪的病理组织学研究

为了解伪狂犬病病毒(PRV)变异株对自然感染仔猪的组织病理损伤,对自然感染发病仔猪进行病理剖检、细菌分离、病毒PCR鉴定、病毒分离培养、病毒粒子观察、基因序列分析及病理组织学观察,证实该发病仔猪为典型的PRV病毒变异株感染发病。病理剖检和病理组织学检查结果显示,发病仔猪脑、心脏、肝、脾、肺、肾等主要器官组织可见典型的猪伪狂犬病剖检病变和病理组织学变化。脑实质中小血管扩张充血,大量胶质细胞浸润,形成明显的血管套和噬神经元现象;肝索紊乱、肝细胞坏死;全身免疫器官淋巴细胞减少等。同时发现PRV在发病仔猪全身分布广泛,且组织中病原含量与组织病理损伤程度密切相关。结果表明,自然发病仔猪感染的PRV变异毒株属于强毒株,具有较强的致病性。