一株马立克病病毒特超强变异株meq基因编辑缺失候选疫苗毒株的构建与鉴定

马立克病(MD)是由马立克病病毒(MDV)感染引起的一种重要的家禽免疫抑制病与肿瘤病,该病可用疫苗进行预防和控制,但在长期免疫压力下MDV的毒力持续增强,经典MD疫苗已难以对当前流行的特超强MDV(HV-MDV)变异株提供良好的免疫保护,亟需研发新一代MD高效疫苗。本文以HV-MDV变异株HNSQ01为亲本毒株,在CEF上连续传代之后,利用CRISPR/Cas9系统对其meq基因进行编辑,通过一系列试验鉴定和分析,最终建立一株meq基因编辑缺失的MD疫苗候选毒株,命名为SQ01Δmeq。1日龄SPF鸡攻毒试验结果显示,在77 d试验周期内,亲本毒株HNSQ01不仅严重抑制感染鸡生长并导致免疫抑制,而且导致100%的MD发病率、100%致死率及80%的肉眼观察肿瘤发生率;但SQ01Δmeq未引起感染鸡的生长及免疫抑制,而且MD发病率、致死率及肿瘤发生率均为0%,表明其对宿主无致病性,生物安全性良好。本研究建立的meq基因编辑缺失MDV毒株SQ01Δmeq,为后续研发新型高效的MD疫苗奠定了重要基础。

白藜芦醇对鼠伤寒沙门氏菌诱导型IPEC-J2细胞损伤的缓解作用

【目的】研究白藜芦醇(resveratrol, RES)对鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)诱导猪小肠上皮细胞(intestinal porcine epithelial cells, IPEC-J2)损伤的缓解作用,为促进动物健康养殖提供新思路。【方法】用鼠伤寒沙门氏菌建立IPEC-J2损伤模型,测定细胞上清液一氧化氮(NO)浓度、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)质量浓度、白介素-6(IL-6)质量浓度、白介素-4(IL-4)质量浓度、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)水平、总超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase, T-SOD)活力、还原型谷胱甘肽(glutathione, GSH)质量浓度和丙二醛(malondialdehyde, MDA)浓度,分析RES对IPEC-J2损伤模型的缓解作用。【结果】RES预处理IPEC-J2细胞的最佳质量浓度为7.8 mg·L^(-1),且能有效缓解鼠伤寒沙门氏菌诱导IPEC-J2细胞产生的炎症损伤,显著降低促炎因子(TNF-α和IL-6)的质量浓度,提高抑炎因子(IL-4)的表达,进而有效减缓肠道炎症反应。同时,RES可显著提高T-SOD活力和GSH质量浓度,显著降低MDA浓度,缓解鼠伤寒沙门氏菌诱发的氧化损伤,达到维持机体肠道氧化还原平衡的稳态。【结论】RES对IPEC-J2损伤具有保护作用,可用于预防鼠伤寒沙门氏菌感染。

马立克病病毒meq基因缺失毒株HN302Δmeq的构建及致病性分析

马立克病(MD)是由马立克病病毒(MDV)感染引起的一种重要的家禽免疫抑制病与肿瘤病,严重危害世界养禽业。随着MDV持续进化及毒力增强,急需研发新型高效的MD疫苗以加强该病的有效防控。本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,以MDV变异株HN302为亲本毒株,成功构建了meq基因缺失的毒株HN302Δmeq,经过PCR扩增鉴定及测序分析,证实meq基因缺失且传代稳定。间接免疫荧光试验(IFA)和实时荧光定量PCR(RT-qPCR)分析均证实HN302Δmeq感染鸡胚成纤维细胞(CEF)中无meq基因表达,并且meq基因的缺失不影响其他病毒基因的表达。利用RT-qPCR分析HN302Δmeq在CEF中的体外增殖曲线,结果显示meq基因的缺失不影响MDV体外复制。1日龄SPF鸡攻毒试验结果显示,与亲本毒株HN302相比,HN302Δmeq对宿主无致病性,其诱导的MD发病率、死亡率和肿瘤发生率均为0,且未观察到明显的免疫器官萎缩。上述数据表明,HN302Δmeq的毒力明显丧失,具备继续作为疫苗候选株开展相关研究的可能性。本研究成功构建了MDV变异株HN302的meq基因缺失毒株,为后续MDV的致病机制及新型疫苗研究奠定了基础。

非洲猪瘟病毒B602L蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗体制备

【目的】非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)是对生猪养殖业危害极大的一种病原体,B602L蛋白作为其重要的非结构蛋白,是衣壳蛋白p72折叠为正确的三级结构的伴侣分子之一,在病毒组装成二十面体结构的过程中发挥着关键作用。特异性抗体对于抗非洲猪瘟免疫应答机制及血清学检测方法研究具有重要意义,本研究旨在获取ASFV B602L蛋白,并制备抗ASFV B602L蛋白的多克隆抗体,为ASFV B602L蛋白功能研究及相关诊断试剂的研发提供材料。【方法】以ASFV China/2018/AnhuiXCGQ株的B 602 L基因为研究对象,应用生物信息学软件对B602L蛋白的理化性质、信号肽、跨膜结构、抗原性和蛋白结构进行分析后,利用同源重组的方法将其克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后经诱导表达获得B602L重组蛋白,利用镍柱亲和层析进行蛋白纯化,通过SDS-PAGE和Western blotting对B602L蛋白纯化效果进行验证。将纯化后的B602L蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,通过间接ELISA方法测定多克隆抗体效价,通过Western blotting和Dot blotting检测多克隆抗体特异性。【结果】生物信息学分析表明,B602L蛋白属于稳定性亲水蛋白,无跨膜区和信号肽。二级结构主要含有α-螺旋(54.91%)、延伸链(9.81%)和无规则卷曲(32.08%)。成功构建了ASFV B602L重组质粒,SDS-PAGE和Western blotting结果显示,重组菌pET-28a-B602L-BL21在16℃、0.5 mmol/L IPTG诱导下高效表达,获得的重组蛋白主要表达在BL21菌株上清中,大小约为70 ku,且能与ASFV阳性血清特异性结合。间接ELISA检测结果显示,制备的抗B602L鼠源多克隆抗体效价达1∶409600,Western blotting和Dot blotting试验结果表明,抗B602L鼠源多克隆抗体能够特异性识别B602L蛋白。【结论】原核表达的B602L重组蛋白具有良好的免疫原性,能够与ASFV阳性血清特异性结合,制备的鼠抗ASFV B602L蛋白多克隆抗体具备较好的生物学活性。本试验结果可为进一步研究ASFV B602L蛋白的生物学功能和非洲猪瘟诊断方法的建立提供生物材料和理论支撑。

不同品种花生芽菜营养品质及活性物质差异分析

为筛选生长快、营养价值高的花生芽菜,对6个品种花生发芽1~9 d的生长特性、营养成分及活性物质差异进行研究。结果表明:不同花生品种的发芽率开农80>黑珍珠>四粒红>鲁花8号>红罗汉>花育42;在发芽期间各品种芽长均显著增加,且品种间差异显著,其中四粒红的芽长最长(5.82 cm),开农80的芽长最短(1.53 cm);各品种的芽长均在发芽后1~3 d增长速度较缓慢,在5~9 d增长较快;蛋白质含量随着发芽天数呈先降后升(P<0.05);可溶性总糖含量先增后降(P<0.05);半胱氨酸含量在一定时间内随发芽时间呈不同程度增加,均在第5天达到峰值,其中增幅最大的是四粒红(12.22%),增幅最小的是开农80(3.27%);发芽能显著增加花生中白藜芦醇的含量,各品种发芽5 d后较发芽初始时白藜芦醇含量增幅从大到小顺序为:四粒红>黑珍珠>鲁花8号>花育42>红罗汉>开农80;发芽后各品种的多酚含量随着发芽天数呈先升后降的趋势,达到峰值时四粒红多酚含量最高(213.99 mg/g)。感官评定综合评分表明,四粒红芽菜色泽、外观形态、滋味、气味评分均高于其他品种。聚类分析结果表明,四粒红是发芽后生长快、营养价值高、感官品质佳的优质花生芽菜品种。该研究可为开发优质花生芽菜及功能性花生食品提供参考。

非洲猪瘟病毒p10蛋白和p49蛋白的生物信息学分析及表位预测

运用多种生物信息技术对非洲猪瘟病毒(ASFV)Georgia 2007/1株p10蛋白和p49蛋白的理化性质、二级及三级空间结构、抗原性、抗原决定簇进行初步分析,并预测其B、T淋巴细胞优势表位。结果表明,p10是亲水性蛋白,含有2个抗原决定簇,该蛋白α-螺旋、β-转角、无规则卷曲和延伸链的比例为32.05%、11.54%、52.56%和3.85%;p49同样是亲水性蛋白,含有17个抗原决定簇,其α-螺旋、β-转角、无规则卷曲和延伸链的比例依次为29.91%、7.53%、55.94%和6.62%。基于以上分析,p10不适合用于ASF疫苗制备的候选蛋白;而p49作为亲水性衣壳蛋白,具有一定免疫原性,有望成为疫苗研制的备选蛋白,为ASFV蛋白研究和疫苗研发提供一定参考。

花生红衣原花青素纯化工艺及其对乳糜泻细胞模型的影响

目的:优化AB-8型大孔树脂对花生红衣原花青素的纯化工艺并对纯化物组分进行表征鉴定。采用乳糜泻模型评价其对细胞毒性的抑制作用。研究方法:选用AB-8型大孔树脂,通过静态、动态吸附-解吸试验对纯化条件进行优化,用紫外-可见光谱、傅里叶红外和高效液相色谱串联质谱(UPLC-QTOF-MS/MS)对纯化物鉴定。基于乳糜泻细胞模型评价纯化物对细胞毒性的抑制作用。结果表明:纯化条件:上样质量浓度1.2 mg/mL,上样液pH值3.0,上样流速1.0 mg/mL,上样量360 mL,吸附时间180 min,解吸液为120 mL的40%乙醇溶液,解吸时间40 min,解吸流速1.0 mg/mL,此时测得该纯化物纯度达95%。紫外-可见光谱分析表明该纯化物属于原花青素类;傅里叶红外分析表明纯化物是以原花青定为主要结构单元,与标准品特征吸收峰趋势相符;UPLC-QTOF-MS/MS分析表明Pspc纯化物以A型原花青素为主要成分;细胞试验结果表明该纯化物在一定程度上可明显抑制乳糜泻模型的毒性作用。研究结果可为花生红衣资源综合开发提供理论参考。

冠状病毒入侵细胞途径的研究进展

近年来,冠状病毒严重威胁人类和动物的健康。病毒具有专性胞内寄生的特点,其需要利用细胞完成自身的增殖,因此入侵细胞的过程是其感染机制中非常重要的一部分。多项研究表明冠状病毒能通过细胞表面途径和内吞途径入侵细胞。通过对冠状病毒入侵途径研究有助于了解其生命周期,有利于冠状病毒的防治以及新型药物和疫苗的研发。本文对近年来不同冠状病毒的入侵途径及针对入侵途径所开发的潜在药物的相关研究进行总结,以期为全面了解冠状病毒的入侵方式提供参考。

非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体制备和鉴定

【目的】制备非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)p30蛋白的单克隆抗体,为非洲猪瘟快速诊断检测方法的建立和疫苗研究提供材料。【方法】构建p30原核表达质粒pET-30a(+)-p30,转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中进行诱导表达,通过镍柱亲和层析获得目的蛋白。p30复性后,每2周对BALB/c小鼠免疫3次,将免疫小鼠的脾脏与骨髓瘤细胞融合制备单克隆抗体,通过ELISA方法和亚克隆筛选分泌抗体的杂交瘤细胞。将筛选出的单克隆细胞注射进小鼠腹腔制备腹水,通过Western blotting检测、免疫荧光测定(IFA)和抗体亚型分析来鉴定单克隆抗体。【结果】试验成功构建了p30蛋白的原核表达质粒,并使用IPTG诱导、纯化获得了原核系统表达的重组p30蛋白;成功制备出4株能稳定分泌针对ASFV p30蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为:1H3B4、3F2F5、6E3A1和9D6B9。经ELISA测定抗体腹水效价在1∶100000~1∶1000000之间。经Western blotting和IFA鉴定筛选得到的单克隆抗体与p30蛋白能发生特异性反应。经亚型鉴定,3F2F5和9D6B92株单克隆抗体的重链均为IgG2b,轻链均为Kappa;6E3A1株单克隆抗体的重链为IgM,轻链为Kappa;1H3B4株单克隆抗体的重链为IgG2b,轻链为Lambda。【结论】试验成功制备了4株针对ASFV p30蛋白的单克隆抗体,并分析了单克隆抗体的免疫学特性,为p30蛋白的生物学功能研究和ASFV血清学检测提供依据。

基于单质粒拯救系统的塞内卡病毒感染性克隆的构建与生物学特性

参考甲型塞内卡病毒(SVA)CH/HuB/2017株全基因组序列,构建SVA通用型载体,合成SVA FragⅠ和FragⅡ基因片段,并通过无缝克隆技术依次将病毒基因片段插入通用型载体,获得包含病毒全基因组的真核转录质粒pcDNA-SVA;经双酶切和测序验证后,在IBRS-2细胞上进行转染和传代,以获得拯救毒株rSVA-CH/HuB/2017;经遗传稳定性评价后,利用蛋白免疫印迹、间接免疫荧光和半数组织培养感染量等试验,鉴定和分析拯救毒株在猪肾细胞系IBRS-2和PK-15中的生物学特性。结果显示,重组质粒pcDNASVA直接转染普通敏感细胞系IBRS-2,即可快速拯救出含有沉默突变NheⅠ分子标记的毒株,且具有良好的遗传稳定性;拯救毒株和野生亲本毒株在IBRS-2和PK-15细胞中的复制和增殖特性相似。结果表明,通过建立一种基于T7启动子、RNA聚合酶Ⅱ启动子、终止子、核酶HamRz和HDVRz等元件的SVA单质粒高效拯救系统,可以在质粒水平快速编辑病毒基因组,为定向改造和拯救病毒提供了基础性技术平台。