不同供体细胞及其处理对猪核移植重构胚体外发育的影响

系统探讨了体细胞的组织来源及培养代数对猪核移植重构胚发育的影响。体外成熟培养40～44h的猪卵母细胞去核后，将经血清饥饿（0．5％FBS）培养2～9天、0．1mg／L Aphidicolin（APD）培养＋0．5％FBS培养2～9天或一般培养法（10％FBS）培养的卵丘细胞、颗粒细胞、输卵管上皮细胞和耳皮成纤维细胞，直接注射到去核的卵母细胞质中，或注射到卵周隙中，再经电融合（100V／mm，30μs，电脉冲1次）构建重构胚．重构胚以钙离子载体A23817或电脉冲结合6．DMAP激活处理，体外培养6天。耳皮成纤维细胞和颗粒细胞经0．1mg／LAPD＋0．5％FBS培养处理后的重组胚卵裂率，均高于血清饥饿和一般培养处理的同种供体细胞（P〈0．01）。卵丘细胞、颗粒细胞经0．1mg／LAPD＋0．5％FBS处理后进行核移植的分裂率和发育率均高于输卵管上皮细胞和耳皮成纤维细胞（P〈0．05）。以猪颗粒细胞为核供体时，电融合法的重构胚分裂率显著高于胞质内注入法（P〈0．05），但囊胚发育率无显著差异（P〉0．05）。培养3代和6代的猪颗粒细胞以及培养6代和10代的耳皮成纤维细胞，其具有正常二倍染色体的细胞比例均无显著差异（P〉0．05）；以这2种细胞不同培养代数做供体进行核移植时，各代之间核移胚的体外分裂率、囊胚发育率无显著差异（P〉0．05）。这些结果表明：（1）猪耳皮成纤维细胞和颗粒细胞经培养传代所建立起来的细胞系相对比较稳定；（2）0．1mg／LAPD预培养处理供体细胞能提高猪体细胞核移植的效果，血清饥饿培养则无明显效果；（3）猪颗粒细胞和耳皮成纤维细胞等均可做供核细胞，核移植后都能得到体细胞克隆的囊胚，但前者的效果略优于后者，且其核移植效果不受供核细胞培养代数的影响；（4）电融合核移植胚胎的发育率高于胞质内直接注入法，但两者的总体效率相近。

影响猪体细胞核移植重构胚体外发育的若干因素

以卵丘细胞为核供体细胞组成重构胚,卵裂率达到56.7%,发育至桑椹胚达11.7%、孵化囊胚率为6.7%,显著高于成纤维细胞组成的重构胚(p<0.05)。我们研究了卵母细胞的采集方法,激活方法和卵龄对卵丘细胞核移植重构胚体外发育的影响。以血清饥饿法将卵丘细胞诱导至GO或G1期,抽吸法/解剖法采集卵母细胞,体外培养33或44 h,将卵丘细胞置于去核卵母细胞的卵周隙中,重构胚以钙离子载体A23817或电脉冲结合6-DMAP激活处理,体外培养6天,结果表明,卵母细胞采集方法、激活液中细胞松弛素(CB)并不影响重构胚的发育(以卵龄44h的卵母细胞为受体);而以电脉冲结合6-DMAP激活处理能提高重构胚发育能力(以卵龄33 h的卵母细胞为受体)(p<0.05)。本研究显示,以电脉冲结合6-DMAP激活卵丘细胞重构胚。

猪卵母细胞去核方法的改进

对猪体细胞克隆技术中关键步骤之一的去核方法作了较深入的研究。结果表明,由本实验室改进的Willadsen去核法———二步挤压去核法,无论在去核操作成功率(73.9%)上还是在去核效率(81.2%)上都明显好于McGrath-Solter去核法(42.5%、67.4%,P<0.05);同时,本试验还发现,卵母细胞成熟培养36 h后去核组去核效率(89.1%)显著地高于成熟培养44 h后去核组(55.8%,P<0.05),而核移植重构胚的发育率2个组间无显著差异。

体细胞的组织来源及培养代数对猪核移植重构胚发育的影响

本研究系统探讨了体细胞的组织来源及培养代数对猪核移植重构胚发育的影响。体外成熟培养40-44h的猪卵母细胞去核后,将经血清饥饿(0．5%FBs)培养2-9d、0．1mg/L Aphidicolin (APD)培养+0．5%FBS培养2-9d或一般培养法(10%FBS)培养的卵丘细胞、颗粒细胞、输卵管上皮细胞和耳皮成纤维细胞,直接注射到去核的卵母细胞质中,或注射到卵周隙中。再经电融合(100V/mm,30μs,电脉冲1次)构建重构胚。重构胚以钙离子载体A23817或电脉冲结合6- DMAP激活处理,体外培养6天。耳皮成纤维细胞和颗粒细胞经0．1mg/L APD+0．5%FBS培养处理后的重组胚卵裂率,均高于血清饥饿和一般培养处理的同种供体细胞(P＜0．01)。卵丘细胞、颗粒细胞经0．1mg/L APD+0．5%FBS处理后进行核移植的分裂率和发育率均高于输卵管上皮细胞和耳皮成纤维细胞(P＜0．05)。以猪颗粒细胞为核供体时,电融合法的重构胚分裂率显著高于胞质内注入法(P＜0．05),但囊胚发育率无显著差异(P＞0．05)。培养3代和6代的猪颗粒细胞以及培养6代和10代的耳皮成纤维细胞,其具有正常二倍染色体的细胞比例均无显著差异(P＞0．05)；以这2种细胞不同培养代数做供体进行核移植时,各代之间核移胚的体外分裂率、囊胚发育率无显著差异(P＞0．05)。这些结果表明：(1)猪耳皮成纤维细胞和颗粒细胞经培养传代所建立起来的细胞系相对比较稳定；(2)0．1mg/L APD预培养处理供体细胞能提高猪体细胞核移植的效果,血清饥饿培养则无明显效果；(3)猪颗粒细胞和耳皮成纤维细胞等均可做供核细胞．核移植后都能得到体细胞克隆的囊胚,但前者的效果略优于后者,且其核移植效果不受供核细胞培养代数的影响；(4)电融合核移植胚胎的发育率高于胞质内直接注入法,但两者的总体效率相近。

猪卵母细胞电激活参数的研究

以体外成熟的猪卵母细胞为对象 ,研究不同卵龄、电场强度、脉冲次数和激活液Ca 、Mg 对猪卵母细胞电激活效果的影响。结果表明 ,1次脉冲就足以激活猪卵母细胞 ,电场强度以 1 2 50～ 1 50 0V/cm为优 ,含Ca 、Mg 的激活液激活效果显著高于非电解质液 ,卵龄以

Fluorogenic Detection of Duck Tembusu Virus( DTMUV ) by Loop-mediated Isothermal Amplification(LAMP)

This study was to develop an efficient and simple method for the detection of duck Tembusu virus( DTMUV) by loop-mediated isothermal amplification( LAMP). Six pairs of LAMP primers were designed according to the conserved region of the DTMUV E gene sequence in Gen Bank,which were then used for the optimization of various reaction components and reaction system of specific LAMP for DTMUV. Further the fluorescent reagent SYBR Green I and a certain proportion of calcium and manganese ion were used to determin the color development of products for visible analysis instead of agarose gel electrophoresis. The results showed that the sensitivity SYBR Green I as the fluorescent reagent was 10 copies viruses per μL,which is 100 times higher than normal PCR method,while the detection limit of combined use of calcium and manganese ion was 1 000 copies viruses per μL. Although the sensitivity of mixture of calcium and manganese ion is lower than SYBR Green I,it can avoid the aerosol contamination. The fluorogenic analysis-based LAMP system established in our study has a high sensitivity and avoid the cross contamination,which is of huge potential in research institutions,grass-roots laboratories and field testing and can provide effective means to completely curb the occurrence and spreading of DTMUV.