西洋参中U6启动子的克隆及表达分析

U6启动子是CRISPR/Cas9基因编辑系统中驱动sgRNA转录的重要元件,该文从西洋参gDNA中克隆得到7条PqU6启动子序列,研究了这7个PqU6启动子的转录激活情况。以培养5周的西洋参不定根为出发材料,克隆7条长度为1300 bp左右的PqU6启动子序列。利用生物信息学工具对PqU6启动子序列特点进行分析,并构建PqU6-P驱动GUS基因的融合表达载体,通过根瘤农杆菌介导法分转化烟草叶片进行活性检测。然后对这7条PqU6启动子分别从5′端截短处理到283、287、279、289、295、289、283 bp,以GUS为报告基因构建启动子活性检测载体并转化西洋参愈伤组织和烟草叶片。结果表明,从西洋参gDNA中克隆得到的7条PqU6启动子序列(PqU6-1P~PqU6-7P),核酸序列长度为1246~1308 bp。序列对比结果显示7条PqU6启动子序列和拟南芥AtU6-P启动子一样具有影响U6启动子转录活性的必要元件USE和TATA框。GUS染色和酶活鉴定结果显示7条PqU6启动子都具有转录活性,其中长度为1269 bp的PqU6-7P转录活性最高,是阳性对照P-35S的1.31倍。将7条PqU6启动子从5′端截短处理后(PqU6-1PA~PqU6-7PA),它们在烟草叶片和西洋参愈伤组织中的转录活性并不一致。当受体材料是西洋参愈伤组织时,长度为283 bp的PqU6-7PA启动子转录活性是AtU6-P启动子(长度为292 bp)转录活性的1.59倍。上述试验结果将为西洋参及人参属等药用植物的CRISPR/Cas9基因编辑技术提供更多理想的内源U6启动子。

西洋参中8个bHLH类转录因子的克隆及表达分析

从西洋参cDNA中克隆得到8个bHLH类转录因子,研究了这8个bHLH类转录因子响应茉莉酸甲酯信号的表达情况。该研究以培养3周的西洋参幼苗为材料,克隆得到了8个bHLH类转录因子。采用高效液相色谱和分光光度法测定了MeJA处理不同时间西洋参不定根中人参皂苷Rg、Re、Rb和总皂苷的含量。利用实时荧光定量PCR检测MeJA处理后8个转录因子的基因表达量。结果表明从西洋参cDNA中克隆得到的8条bHLH类转录因子序列(Pq-bHLH21~Pq-bHLH28)核酸序列长度为762~2 013 bp。8个转录因子的氨基酸序列一致性为24.90%,每个氨基酸序列都显示出了基本的bHLH保守结构域特征,属于bHLH超基因家族成员。Pq-bHLH22和Pq-bHLH24~Pq-bHLH27共5条氨基酸序列中含有bHLH-MYC N结构域,属于bHLH基因家族中的MYC类转录因子。MeJA处理48 h内,8个转录因子都存在应答响应。在MeJA处理72 h时,Pq-bHLH24的基因表达量达到了处理组最高的106.53倍。在相关性分析方面,Pq-bHLH25、Pq-bHLH27、Pq-bHLH28表现出较强的协同趋势,Pq-bHLH21可能参与调控人参皂苷Rb生物合成途径,而3个转录因子Pq-bHLH22、Pq-bHLH25、Pq-bHLH28与人参皂苷Re生物合成途径呈显著正相关。上述工作为进一步研究bHLH类转录因子对于人参皂苷生物合成调控的功能验证奠定基础。