PPARγ激动剂对T细胞增殖及破骨细胞形成的影响

目的:观察过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator activated receptor-γ,PPARγ)激动剂15d-PGJ2对小鼠T细胞增殖、T细胞分泌的细胞因子表达及破骨样细胞形成的影响,并探讨其可能的作用机制。方法:体外分离伴放线放线杆菌(A.actinomycetetemcomitans,Aa)免疫的BALB/c小鼠颈部淋巴细胞,提取T细胞进行体外扩增,分别加入浓度为0、1×10-8、1×10-7,1×10-6,1×10-5mol/L的15d-PGJ2进行干预。培养3d后,3H-Tdr掺入法测定T细胞的增殖反应;ELISA法测定细胞上清中核因子-κB受体活化因子配体(receptor activator of NF-κB ligand,RANKL)、TNF-α和IL-10的表达水平;取扩增的T细胞上清与RAW 264.7细胞共同培养后,抗酒石酸酸性磷酸酶染色(tartrate resistant acid phosphatase,TRAP)测定破骨样细胞的形成。采用SPSS 11.0软件包对数据进行统计学分析。结果:以1×10-5mol/L 15d-PGJ2处理的小鼠T细胞3d后,与对照组相比,T细胞增殖显著受抑;上清中RANKL、TNF-α的表达水平下降,IL-10无显著变化;TRAP染色阳性细胞数减少,具有统计学意义(P<0.05),且呈浓度依赖性。结论:PPARγ激动剂15d-PGJ2可抑制T细胞增殖,减少炎性因子分泌,降低破骨样细胞的形成,提示PPARγ配体在抑制T细胞诱导的骨吸收方面发挥积极作用。

维生素A对牙周致病菌免疫小鼠免疫应答调节的作用

目的:探讨维生素A缺乏对特异性牙周致病菌—伴放线放线杆菌(A.actinomycetetemcomitans,Aa)引起的小鼠免疫应答作用的影响。方法:整个实验过程采用无维生素A饮食(vitamineA-depleted diet,VAD)或常规维生素A饮食(vitamine A-sufficient regulardiet,RD)喂养BALB/c鼠。2周后,免疫Aa建立免疫动物模型,6周后处死小鼠,ELISA法测定血清中的抗Aa特异性抗体总IgG、IgM及IgG亚类抗体滴度及细胞上清中细胞因子的浓度,3H-Tdr掺入法测定T细胞增殖反应。实验结果采用SPSS11.5软件包进行统计学分析。结果:Aa免疫的总IgG和IgM抗体水平明显升高,非免疫组则不能产生抗体。Aa免疫+VAD组与Aa免疫+RD组相比,总IgG水平显著升高(P<0.05);IgG2a的抗体水平明显增加,而IgG1亚型的抗体水平却明显降低,差异显著(P<0.05)。Aa免疫组可诱导机体产生较强的特异性T细胞免疫反应,而Aa免疫+VAD组T细胞增殖反应明显高于Aa免疫+RD组,具有统计学差异(P<0.05);细胞上清中RANKL、IFN-γ及TNF-α的表达增加,IL-10的表达降低(P<0.05)。结论:饮食中维生素A缺乏,可增加Aa免疫鼠引起的免疫炎症反应,提示充足的维生素A是维持机体健康的重要因素。

B淋巴细胞对牙周致病菌免疫反应及骨细收因子RANKL表达的影响

目的:通过评价B淋巴细胞与牙周致病菌——伴放线放线杆菌(Aa)发生免疫反应过程中核因子-КB受体活化配体(RANKL)的表达,探讨B淋巴细胞是否参与Aa引起的牙周骨吸收。方法:采用RT-PCR方法测定大鼠脾细胞中第1和7d细胞因子的mRNA转录水平,采用流式细胞技术测定大鼠脾细胞中B细胞表达RANKL IgG阳性细胞的百分数,应用TRAP法评价B淋巴细胞对破骨细胞分化的诱导潜力。实验结果采用SPSS 10.0软件包进行分析。结果:在无Aa抗原刺激的条件下,大鼠脾细胞培养1d和7d的TNF-α及IL-4表达水平均升高,IL-10、RANKL的表达水平无明显变化;加入Aa组培养1d时,TNF-α的表达显著增加,7d后,IL-4、IL-10及RANKL的mRNA转录水平显著增加;B细胞的百分数以及表达RANKL的IgG阳性细胞百分数与不加Aa组相比显著增加;Aa免疫组加入Aa培养后,表达RANKL的IgG阳性细胞百分数增加显著高于非免疫组。Aa免疫组的B淋巴细胞与RAW 264.7细胞共同培养后,TRAP染色阳性细胞显著增加(P<0.01);加入人OPG-Fc培养,可显著抑制TRAP阳性细胞的形成(P<0.05)。结论:B淋巴细胞经特异性抗原Aa活化后,通过上调RANKL的表达,增加对破骨细胞分化的诱导潜力,参与牙周骨吸收。

抗RANKL多克隆抗体对P.gingivalis感染的大鼠牙周骨吸收的抑制作用

目的评价抗NF-кB受体活化因子配体(RANKL)多克隆抗体对P.gingivalis感染引起的牙周骨吸收的抑制作用。方法将大鼠重组的RANKL对兔进行免疫获得兔抗鼠RANKL多克隆抗体,应用兔抗鼠RANKLF(ab')2抗体片断以防止免疫抑制。实验用大鼠口腔连续4d感染活P.gingivalis(109/ml/d),第5、9及14天于腭侧牙龈乳头处注射兔抗鼠RANKLF(ab')2抗体片断(1μg/部位),OPG-Fc(1μg/部位)及不相关细胞因子L6-Fc(1μg/部位),第28天处死,取样待检。取实验当天、实验14天及28天血清,ELISA法测定血清抗P.gingivalis的特异性IgG抗体滴度及牙龈组织匀浆液中的可溶性RANKL(sRANKL)的表达水平,采用SPSS11.5统计软件包进行分析。结果口腔感染P.gingivalis后血清抗P.gingivalis的特异性IgG抗体滴度明显升高,且一直持续到第28天;局部注射抗RANKL抗体并不降低血清中抗P.gingivalis的特异性IgG抗体滴度。注射抗体组和OPG-Fc组的sRANKL的表达明显下降(<0.05),与对照组相比具有统计学意义,而注射L6-Fc组sRANKL的表达无改变;牙周骨吸收的水平变化与牙龈组织匀浆液中RANKL的表达水平相一致。结论抗RANKL多克隆抗体可降低牙龈组织中的可溶性RANKL的含量,抑制P.gingivalis感染的牙周骨吸收。

抗RANKL多克隆抗体抑制T细胞介导的破骨细胞形成的体外研究

目的:探讨抗核因子-КB受体活化因子配体(RANKL)多克隆抗体对T细胞介导的破骨细胞形成的影响。方法:制备兔抗鼠RANKL多克隆抗体,使用不同浓度的抗体(1、5及10μg/mL),观察小鼠重组RANKL诱导的破骨细胞形成,显微镜下计数抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)阳性多核细胞数/孔;体外分离、纯化、扩增大鼠的颈T淋巴细胞,给予不同浓度的兔抗鼠RANKL特异性抗体进行干预,取其上清和T细胞,分别与RAW264.7细胞共同培养,TRAP法测定T细胞介导的破骨细胞形成,显微镜下计数TRAP(+)多核细胞数/孔;ELISA测定细胞上清中的可溶性RANKL浓度(sRANKL,pg/mL)。实验结果采用SPSS11.5软件包进行统计学分析。结果:兔抗鼠RANKL抗体既可减少RANKL诱导的TRAP(+)多核细胞数,也可减少T细胞介导的TRAP(+)多核细胞数,5μg/mL及10μg/mL抗体组差异显著(P<0.05),且呈浓度依赖性;上清中检出sRANKL的浓度与不加抗体对照组相比明显降低,具有统计学意义(P<0.05)。结论:抗RANKL特异性抗体可通过减少sRANKL的表达水平,直接阻断RANKL与核因子-КB受体活化因子(RANK)的结合,降低T细胞介导的破骨样细胞吸收。

维甲酸对小鼠T细胞增殖及骨破坏因子RANKL表达的研究

目的探讨全反式维甲酸对体外培养的小鼠T淋巴细胞的增殖及核因子-КB受体活化因子配体(RANKL)表达的调节作用及相关机制。方法体外分离Aa感染的BALB/C小鼠颈T淋巴细胞,分别加入浓度为0、1×10-8、1×10-7、1×10-6、1×10-5mol/L的全反式维甲酸,培养3 d后,取100μl上清保存在-70℃冰箱中,以备sRANKL及IL-10等细胞因子的测定;另加入100μl含有3Hthymidine(0.5μCi/孔)RPMI培养液继续培养18 h,进行T细胞3H增殖率测定。结果维甲酸处理组与非处理组相比,T细胞3H增殖率下降;上清中RANKL的表达水平下降,IL-10的表达水平增强(P<0.05),二者具有负相关性(r=-0.774,P=0.001),且呈剂量依赖性。结论维甲酸可通过上调IL-10的表达并下调T细胞上的RANKL的表达水平,抑制T细胞的免疫功能,且呈剂量依赖性。

NF-κB受体激活蛋白配体抗体抑制T细胞介导的牙周骨吸收

目的通过牙周病动物模型，评价NF-κB受体激活蛋白配体（receptor activator of NF-κB ligand，RANKL）抗体对T细胞诱导的牙周骨吸收的作用。方法经鼠尾静脉回输体外分离、纯化、扩增的T淋巴细胞，牙龈局部微量注射T细胞特异性抗原，形成牙周病动物模型，实验前1d及实验第1、3d，在牙龈同样部位注射不同浓度RANKLF（ab’）2抗体片段进行干预。酶联免疫吸附测定法检测血清中鼠抗兔IgG抗体水平及牙龈组织中可溶性RANKL（soluble RANKL，sRANKL）的表达水平；显微镜下测量上颌磨牙牙槽骨吸收；抗酒石酸酸性磷酸酶染色法测定牙槽骨表面破骨细胞的形成。结果鼠牙周病模型经RANKL抗体干预后，小剂量抗体（O．015、0．15及1．5斗∥鼠）不产生免疫性，与实验当天相比差异无统计学意义（P〉0。05）；高浓度组（10μ/鼠）在实验后7、10d测得的血清中鼠抗兔IgGA_405，值分别为0．64±O．12及0．55±0．03，差异有统计学意义（P〈0．01），可产生明显的免疫反应；牙龈组织匀浆液中sRANKL的表达水平及牙槽骨吸收明显减少，除0．015μg组与对照组相比差异无统计学意义外，其他浓度抗体组牙龈组织中sRANKL的表达水平（由279．11±19．32分别降至146．03±11．21、118．24±20．52、110．72±7．11）及牙槽骨吸收率（由20．83±0．78分别降至15．95±1．21、12．72±0．82、12．61±0．79）均明显减少，与对照组相比差异有统计学意义（P〈0．05）；牙槽骨表面的破骨样细胞数也明显减少[由（83．57±7．73）个／mm减少至（58．07±9．57）个／mm]，抗体组与非抗体组相比差异有统计学意义（P〈0．05）；牙龈组织中RANKL的表达与牙周骨吸收呈显著正相关（r^2=0．995，P〈0．01）。结论RANKL抗体可通过减少RANKL的表达水平，直接阻断RANKL的作用，抑制T细胞诱导的牙周骨吸收。