应用实时荧光定量PCR测定AdEasy系统中重组腺病毒滴度(英文)

目的 :确立一种高效、简便的荧光实时定量PCR方法 ,对AdEasy系统中的重组腺病毒滴度进行测定。方法 :采用Stratagene公司的AdEasyTM载体系统在 2 93细胞中构建重组腺病毒 ,经 10倍梯度稀释的病毒母液用以提取基因组DNA及空斑测定。以 10倍梯度稀释的pAdEasy质粒作为标准模板进行实时PCR反应扩增六邻体基因片段 ,并绘制标准曲线。然后以上述的重组腺病毒DNA为模板 ,采用同样体系进行实时PCR反应 ,同时用琼脂糖空斑法测定病毒母液的滴度。结果 :成功构建了重组腺病毒并对其进行了空斑测定。运用标准模板进行的PCR反应显示该方法的线性范围为 10 1～ 10 8拷贝。病毒母液的DNA拷贝浓度(vg/ml)值 ,约为空斑滴度 (pfu/ml)值的 10倍。结论 :荧光实时定量PCR方法可在较大的线性范围内检测重组腺病毒滴度 ,较之空斑法更为准确地反映了重组腺病毒的实际数量。