PAK6基因的克隆、抗体制备及在前列腺癌中的表达

目的在克隆P21相关激酶6(PAK6)全长cDNA的基础上,进一步克隆PAK6-N端基因并使其在大肠杆菌中高效表达,纯化基因产物并进行多克隆抗体制备,为研究PAK6与疾病的关系奠定基础。同时研究PAK6在前列腺癌中的表达。方法根据人全长PAK6cDNA序列,设计PCR引物,以人前列腺癌cDNA文库为模板利用PCR技术克隆PAK6全长cDNA。在此基础上,以PAK6全长cDNA为模板克隆PAK6-N端基因,将扩增产物克隆至大肠杆菌表达载体pGEX-4T-1中,经EcoRIXhoI双酶切鉴定后,进行DAN序列测定。GST-PAK6-N融合蛋白在硫代半乳糖苷(IPTG)诱导下在大肠杆菌BL21中得到表达。利用Glutothione亲和层析纯化融合蛋白,用纯化的GST-PAK6-N融合蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,并用纯化的抗PAK6多克隆抗体在3例前列腺癌病人标本中进行了免疫组化表达的初步研究。结果成功克隆了PAK6全长cDNA和PAK6-N端基因片断,在E.coli中表达了PAK6-NT,纯化了GST-PAK6-N融合蛋白,并制备了PAK6特异性抗体。免疫组织化学研究表明:3例前列腺癌患者石蜡包埋病理组织切片免疫组化染色全部表现为间质阳性,PAK6在前列腺癌间质中呈现表达,而前列腺癌细胞则不染色。结论首次克隆了PAK6全长cDNA和PAK6-N端基因片断并成功制备了PAK6特异性抗体,为深入探讨PAK6在前列腺癌中的作用奠定了基础。

p21激活的磷酸化蛋白激酶6基因克隆、重组质粒载体的构建和序列分析

目的测定PAK6在前列腺癌中的表达,探讨PAK6与前列腺癌的关系。方法根据人全长PAK6cDNA序列,设计PCR引物,以人前列腺癌cDNA文库为模板利用PCR技术克隆PAK6全长cDNA。在此基础上,进行DAN序列测定。结果成功克隆了PAK6全长cDNA,构建了pGEX-4T-1-PAK6-NT重组质粒载体并进行了序列测定。结论克隆PAK6全长cDNA并进行了序列测定,为深入探讨PAK6在前列腺癌中的作用奠定了基础。

Migfilin基因的克隆和真核表达载体的构建

目的克隆Migfilin全长cDNA,构建Flag-migfilin真核表达载体并进行序列测定,为研究migfilin与疾病的关系奠定基础。方法根据人全长migfilin cDNA序列,设计PCR引物,以人前列腺癌cDNA文库为模板,利用PCR技术克隆migfilin全长cDNA。将扩增出的目的基因克隆至pCR2.1载体,经XbaI/HindIII双酶切后进行重组质粒鉴定,DNA序列测定。将测序正确的目的基因克隆至Flag载体并鉴定。结果成功克隆了migfi-lin全长cDNA,序列测定表明与已知migfilin基因序列一致。在此基础上,构建了Flag-migfilin真核表达载体并进行了鉴定。结论Flag-migfilin真核表达载体构建成功,为深入探讨migfilin在大肠癌中的作用奠定了基础。