人BIGH3基因克隆表达对兔角膜基质细胞黏附和迁移的影响

背景:BIGH3蛋白位于角膜上皮和基质层,在基质层高表达,先前研究已经发现BIGH3蛋白能促进角膜上皮创伤愈合,为此进一步探讨其对角膜基质创伤愈合的影响。目的:构建人BIGH3基因的原核表达载体,观察其对角膜细胞与细胞外基质黏附和迁移的作用。方法:PCR扩增BIGH3基因的ORF阅读框,并通过KpnI和SalI插入到原核表达载体pET32a(+)中。经PCR、酶切和序列测定方法鉴定重组质粒。将重组质粒转入BL21(DE3)表达,IPTG诱导表达人BIGH3融合蛋白,并进行SDS-PAGE电泳分析和Westernblot检测分析;以Ni-NTA树脂对蛋白纯化与复性,作用于体外培养的兔角膜细胞,用MTT法分析其对细胞与细胞外基质黏附的影响,采用改良的Boyden微孔膜双槽法观察BIGH3蛋白对角膜细胞迁移的影响。结果与结论:重组质粒经PCR、酶切与DNA测序证实插入了pET32a(+)载体中。通过IPTG诱导,成功的表达融合蛋白在包涵体中,经SDS-PAGE电泳分析,出现了一条新生的蛋白条带,Westernblot也证实了该蛋白具有与BIGH3抗体特异性的结合能力。MTT法和Boyden微孔膜双槽法分别证明所表达的BIGH3融合蛋白可促兔角膜细胞黏附和迁移。成功构建了人BIGH3重组融合蛋白表达质粒,纯化了该基因的原核表达产物,并通过重组融合蛋白BIGH3能促进兔角膜细胞与细胞外基质黏附及迁移,而验证了重组BIGH3蛋白的活性。