小鼠MME基因真核表达载体的构建与鉴定

目的 克隆小鼠巨噬细胞金属弹力酶 (MME)基因结构域Ⅰ和Ⅱ ,构建真核细胞表达载体 ,用于动物肿瘤原位种植模型的研究。方法 通过PCR选择性扩增MME基因结构域Ⅰ和Ⅱ ,克隆入 pGEM T载体中 ,限制性内切酶、DNA序列分析鉴定目的基因后 ,定向亚克隆到真核细胞表达载体pcDNA3 1中 ,并进行双酶切及PCR鉴定。 结果 以MMEcDNA为模板进行PCR扩增的特异性片段在 75 0bp和10 0 0bp之间。以此构建的pGEM T MME克隆载体和表达载体 ,经限制性内切酶酶切证实载体中带有MME目的基因片段 ;与小鼠MMEcDNA序列的碱基符合率为 99 6 3% ;证明MME基因已正确克隆到了真核细胞表达载体pcDNA3 1中。结论 成功构建了 pcDNA3 1 MME重组质粒 ,奠定了转基因研究MME表达与肿瘤生长转移关系的实验基础。

低氧诱导因子-1α干扰RNA对血管内皮生长因子mRNA表达的抑制作用

目的探讨低氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)特异性小片段干扰RNA表达载体pSU-PERH1-siHIF1α对低氧诱导因子-1α和血管内皮生长因子(vas-cular endothelial growth factor,VEGF)mRNA表达的抑制作用。方法构建HIF-1α特异性小片段干扰RNA表达载体pSUPERH1-siHIF1α,通过脂质体Lipofectamine2000分别介导pSUPERH1-siHIF1α转染低氧状态下培养的人低分化鼻咽鳞癌细胞(nasopharyngeal carcinoma cell line,CNE2),对照组转染pSUPER空载体,采用半定量RT-PCR方法检测HIF-1αmRNA和VEGFmRNA的表达。结果转染pSUPERH1-siHIF1α的CNE2细胞中HIF-1αmRNA和VEGFmRNA的表达较对照组分别降低79.4%和65.7%。结论HIF-1α特异性小片段干扰RNA表达载体pSUPERH1-siHIF1α能明显抑制HIF-1αmRNA和VEGFmRNA的表达。

大鼠前列腺上皮细胞角蛋白8mRNA表达调节的定位研究

本文应用反义RNA探针原位杂交法,研究雄激素对大鼠腹侧前列腺(VP)上皮细胞角蛋白(CK)8 mRNA表达的影响。发现1.在任何VP组织切片中,CK 8探针专一、大量定位于VP腺上皮细胞中,CK 8 mRNA是前列腺上皮细胞特异而灵敏的标志。2.去睾大鼠VP CK 8 mRNA染色增强,提示CK 8mRNA有过度表达,注射雄激素又可抑制其过度表达。3.与已知受雄激素抑制性基因不同,即使大鼠VP完全萎缩之后达2个月之久,其存留腺上皮细胞CK 8 mRNA表达仍持续增高。4.前列腺发育早期,迅速增殖的幼稚腺上皮细胞高度表达CK 8 mRNA,以后随着体内雄激素水平升高,VP上皮CK 8 mRNA表达下降,分布转移。以上结果进一步支持前列腺CK 8基因是新的一类受雄激素抑制性基因的推测,同时表明前列腺CK 8基因的表达与前列腺干细胞的增殖分化有密切联系,CK 8 mRNA高度表达是前列腺干细胞一个重要特征。

单克隆抗体MS57-2.1在胃癌生物学中的实验研究

目的:鉴定单克隆抗体MS57-2.1(简称MS57-2.1单抗)的胃癌特异性,研究MS57-2.1单抗的体外和体内抑瘤功能,为胃癌的靶向治疗提供候选抗体药物。方法:本课题组前期利用4个胃癌细胞株膜蛋白免疫A/J小鼠,通过杂交瘤联合高通量流式细胞技术筛选并获得抗胃癌MS57-2.1单抗。通过流式细胞和ELISA检测MS57-2.1单抗的胃癌特异性。通过免疫荧光技术鉴定MS57-2.1单抗的靶抗原在胃癌细胞的定位。通过体外和体内实验初步研究MS57-2.1单抗抑制胃癌细胞移动以及侵袭的作用。结果:流式细胞检测结果表明MS57-2.1单抗可以高亲和力与特定胃癌细胞株结合,而几乎不与正常人外周血细胞结合。ELISA结果表明MS57-2.1单抗可与胃癌组织膜蛋白结合,而不与幽门螺杆菌及胃癌细胞分泌蛋白结合。免疫荧光检测表明MS57-2.1单抗的靶抗原定位于胃癌细胞膜表面。在Transwell小室迁移和侵袭实验中,MS57-2.1单抗处理后胃癌细胞MKN45和BGC823移动能力受到明显抑制,穿过小室细胞数和穿膜细胞数显著低于无关同型单抗对照组和空白对照组。在裸鼠实验中,MS57-2.1单抗处理组的裸鼠肿瘤播散程度显著低于无关同型单抗对照组和空白对照组。结论:MS57-2.1单抗具有抑制胃癌细胞迁移、侵袭和播散的作用,是胃癌靶向治疗具有潜在应用价值的候选抗体药物。

干扰素α诱导PML蛋白表达抑制前列腺癌细胞生长

PML是一个生长和转录抑制因子,研究表明PML表达变化可能和一些实体癌的发生有关。PML是干扰素的靶基因,可以被干扰素诱导,认为PML可能部分介导了干扰素的抗肿瘤细胞生长作用。我们的研究结果提示,干扰素对前列腺癌细胞生长的抑制作用可能直接和干扰素诱导PML生长抑制因子表达相关,我们的结果支持干扰素抑制肿瘤细胞生长的作用部分是通过其诱导PML生长抑制因子表达来实现的构想。

饮食与胆囊癌关系的流行病学研究

目的探讨饮食因素与胆囊癌发病的关联,为采取预防措施提供科学依据。方法采用全人群病例对照研究,研究对象为1997年6月-2001年5月期间确诊的、年龄在35-74岁的上海市区368例胆囊癌新发病例以及按性别、年龄(5岁一组)频数配对的895例人群对照。采用非条件logistic回归模型分析饮食各因素与胆囊癌的关系。结果女性中,与最低四分位数组相比,葱属类蔬菜年摄入次数最高四分位组的调整OR为0.55(95%CI:0.31-0.97;Ptrend=0.06);与不吃组比较,大蒜头和洋葱最高摄入组的调整OR分别为0.59(95%CI:0.34-0.99;Ptrend=0.03)和0.52(95%CI:0.30-0.91;Ptrend=0.01)。与最低四分位组比较,腌制品摄入其余各组调整OR在女性中依次为1.06、1.88、2.31,Ptrend<0.001;与不吃乳腐组比较,余三组的调整OR依次为1.19、1.47、1.88.Ptrend<0.01。男性结果与女性类似,腌制品和葱属类蔬菜摄入的各组OR都有不显著的升高和降低。结论新鲜蔬菜,尤其是葱属类蔬菜对胆囊癌的保护作用在女性比男性明显,而且以大蒜头、洋葱的保护作用较为显著。而腌制品摄入,尤其是乳腐,可能会增加胆囊癌的发病风险。

吸烟、饮酒与胆道癌关系的全人群病例对照研究

目的 探讨吸烟、饮酒与胆道癌的关系。方法 采用全人群病例对照研究 ,研究对象为 1997年6月 1日～ 2 0 0 1年 5月 31日期间确诊的、年龄在 35～ 74岁的上海市区 6 2 7例胆道癌新发病例以及按性别、年龄 (5岁一组 )频数配对的 95 9例人群对照。采用非条件logistic回归模型分析吸烟、饮酒与胆道癌的关系。结果 男性中 ,吸烟对肝外胆管癌和壶腹癌各组的调整OR均大于 1,现仍吸烟者的调整OR分别为 1.5 1(95 %CI:0 .86～ 2 .6 6 ) ,1.5 8(95 %CI:0 .6 9～ 3.5 8) ;OR随吸烟年限增加和开始吸烟年龄提早有所升高 ,但均未达显著水平。饮酒对胆道癌各组OR均无统计学意义。结论 吸烟也许与肝外胆管癌、壶腹癌有联系 ,未发现吸烟与胆囊癌的显著性关联 ;未发现饮酒与胆道癌的显著性关联。

身体质量指数及腰臀围比与胆道癌关系的探讨

目的:探讨身体质量指数(BMI)、腰臀围比(WHR)与胆道癌的关系。方法:采用非条件logistic回归模型分析身体质量指数、腰臀围比与胆道癌的关系。结果:与正常BMI组比较,胆囊癌女性20～29岁、30～39岁肥胖组的OR与趋势检验均达到或接近显著水平。与腰臀围比四分位最低组比较,胆囊癌和肝外胆管癌男女性最高四分位组OR和趋势检验均达到显著水平。结论:青年时期肥胖可能会增加胆囊癌的发病风险;腰臀围比也是胆囊癌和肝外胆管癌独立的危险因素。

14-3-3σ负调控Akt抑制Rat1-Akt细胞成瘤性

目的:研究腺病毒介导14-3-3.σ(Ad-14-3-.3σ)对Akt过表达Rat1-Akt细胞成瘤性的作用,并探讨其作用是否通过负调控Akt而实现。方法:通过半体内和体内实验观察Ad-14-3-.3σ转染对Rat1-Akt细胞在裸鼠中成瘤性的影响;采用W estern b lotting方法检测转染14-3-.3σ基因后肿瘤组织内14-3-.3σ蛋白及其对Akt蛋白、Akt磷酸化活性和Akt磷酸化底物水平的影响。结果:无论体外用Ad-14-3-3σ处理Rat1-Akt细胞,还是体内经瘤内注射Ad-14-3-3σ,均可见14-3-3.σ可使荷瘤鼠肿瘤体积显著缩小(P<0.05),出现肿瘤的时间推迟,其中以长时间不间断给药疗效最好;转染14-3-.3σ基因治疗组的肿瘤组织中Akt蛋白、Akt-Thr308位点磷酸化活性及Akt磷酸化底物水平低于转染Ad-β-gal或PBS处理的对照组。结论:14-3-3σ可抑制Rat1-Akt细胞在裸鼠中的成瘤性,14-3-3σ通过负性调控Akt蛋白水平和磷酸化活性而抑瘤。

IL-21及其在自身免疫病中的研究进展

白介素-21(IL-21)是近年来被发现和关注的一个四螺旋束的细胞因子,主要由活化的CD4^+Th细胞和NKT细胞分泌,与IL-2、IL-4和IL-15具有高度同源性。它的受体属于Ⅰ型细胞因子受体,由α链和γc链组成,广泛分布于T细胞、B细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞、巨噬细胞和角质化细胞等细胞表面,在固有免疫和适应性免疫中发挥重要作用。IL-21具有多效性,在类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、炎症性肠病等一些自身免疫病的发病机制中起着重要的作用。本文就IL-21及其与自身免疫病的关系作一综述。

14-3-3σ调控p27抑制Rat1-Akt细胞增殖

目的:研究腺病毒介导14-3-3.σ(Ad-14-3-.3σ)对Akt过表达Rat1-Akt细胞增殖的影响,并探讨其作用是否通过调控p27而实现。方法:通过5-溴-2′脱氧尿嘧啶(B rdU)实验检测Ad-14-3-3.σ对Rat1-Akt细胞增殖的影响,并通过激酶分析法和免疫荧光实验探讨Ad-14-3-3.σ对p27磷酸化水平及其在细胞内定位的影响。结果:Ad-14-3-3σ转染的细胞B rdU阳性率(45%)低于PBS处理组(100%)或Ad-β-gal转染的对照组细胞(98%)。14-3-3σ可降低磷酸化p27的水平和减少Akt介导的p27在胞浆中的定位。结论:转染14-3-3σ基因能抑制Akt过表达细胞株Rat1-Akt增殖,14-3-3σ通过降低Akt激酶磷酸化p27的活性,阻断Akt介导的p27胞浆错位,从而发挥其抑制Rat1-Akt细胞增殖。

GE7导入系统介导抑癌基因NOEY2体内导入治疗人上皮性卵巢癌裸鼠腹水瘤

目的 研究GE7导入系统介导抑癌基因NOEY2体内导入后对人上皮性卵巢癌裸鼠腹水瘤的治疗作用。方法 将人上皮性卵巢癌细胞株skov3ipl细胞种植于裸鼠腹腔内建立腹水瘤模型。将生理盐水、GE7 pcD NA3四元复合体及GE7 pcDNA3 NOEY2四元复合体导入荷瘤裸鼠体内研究其抑制肿瘤生长作用。结果 人上皮性卵巢癌裸鼠腹水瘤的成瘤率达 90 % ,GE7 pcDNA3 NOEY2四元复合体腹腔注射后第 2周裸鼠的体重较对照组明显减轻 (P <0 .0 5) ,但第 3周起 3组体重无明显差异。 3组裸鼠的生存期无明显差异。结论 GE7导入系统介导抑癌基因NOEY2体内导入后能延缓但不能抑制上皮性卵巢癌腹水的生长 ,且对腹水瘤裸鼠的生存期无明显延长作用。人上皮性卵巢癌裸鼠腹水瘤模型具有实用性。

胆囊癌与妊娠关系的全人群病例对照研究

目的探讨胆囊癌与妊娠的关系.方法采用全人群病例对照研究,研究对象为1997年6月1日～2001年5月31日期间确诊、年龄在35～74岁的上海市区女性胆囊癌269例以及按年龄(5岁一组)频数配对的538名人群对照,采用非条件lo-gistic回归模型分析妊娠与胆囊癌的关系.结果胆囊癌合并胆石症者中,与妊娠次数≤2次者比较,妊娠次数(3次,4次,5次及≥6次)的各组调整OR分别为1.33(95%CI:0.59-2.99),1.34(95%CI:0.58-3.11),1.39(95%CI:0.57-3.43)和2.67(95%CI:1.12-6.41),趋势检验P=0.03.结论多次妊娠可能通过胆石症影响胆囊癌的发生,生育因素导致的女性体内雌、孕激素水平的升高可能在胆囊癌病因学中起一定的作用.

乳腺癌游离皮瓣乳房重建术后的麻醉管理

背景与目的:围术期的麻醉管理对游离皮瓣乳房重建术成功与否至关重要。该研究拟探讨游离腹壁下深血管穿支皮瓣(deep inferior epigastric perforator flap,DIEP)乳房重建术中的补液、血流动力学以及体温管理。方法:收集自2011年6月—2015年12月共126例接受DIEP乳房重建术的患者资料。回顾性分析患者术后并发症、术中补液速度、以下时点的平均动脉血压(mean arterial blood pressure,MAP)和中心体温:麻醉诱导前(T0)、皮瓣切取完毕移植前(T_1)、皮瓣血管吻合完毕后15 min(T_2),手术结束(T_3)。结果:9例患者发生皮瓣危象,其中7例解救成功,2例失败。术中平均补液速度为(5.44±1.66)(m L·kg-1)/h。T_0、T_1、T_2和T_3的MAP分别为(87.45±8.90)、(74.19±8.63)、(74.60±8.71)和(79.62±7.88)mm Hg。T_0、T_1、T_2和T_3的中心体温分别为(36.69±0.14)、(36.36±0.18)、(36.27±0.14)和(36.21±0.15)℃。结论:研究者应该针对游离皮瓣乳房重建术中的补液、血流动力学以及体温管理建立规范化标准,以优化皮瓣转归。

吉非替尼治疗复治、晚期非小细胞肺癌的临床分析

目的：观察晚期非小细胞肺癌（NSCLC）患者接受吉非替尼（gefitinib）治疗后的生存期、缓解率、疗效。方法：分析2000年12月-2003年10月美国M．D．Anderson癌症治疗中心与上海市胸科医院接受吉非替尼250mg／d口服治疗的共175例晚期NSCLC患者。用Kaplan-Meier及logrank进行生存分析和比较，并用Cox多因素回归分析生存相关因素。用x^2检验比较不同因素在缓解率及疾病控制方面有无差异，logistic多因素回归分析疾病控制率、缓解率的相关因素。结果：175名患者的中位生存期（MST）为6．9个月（95％CI：4．19～9．61）；中位无疾病进展时间（PFS）为3．47个月（95％CI：2．67～4．27）。Cox多因素分析显示性别（P=0．002）、年龄（P〈0．001）、治疗前血红蛋白水平（P=0．034）、PS评分（P=0．019）、既往化疗方案次数（P=0．013）、病理类型（P=0．030）是影响生存的独立因素。性别（P=0．002）、PS评分（P=0．013）是影响PFS的独立因素。所有患者的缓解率为10．14％；疾病控制率为40．54％。影响缓解率与疾病控制率的多因素分析提示性别（P=0．041）、年龄（P=0．035）、吸烟情况（P=0．038）是影响缓解率的独立因素，而性别是影响疾病控制率的独立因素（P=0．036）。结论：吉非替尼治疗复治、晚期NSCLC患者是安全、有效的。

不同化疗药物对结肠癌细胞获得性TRAIL基因耐药的逆转作用

目的:探讨不同化疗药物对结肠癌DLD1细胞获得性TRAIL基因耐药的逆转作用及其可能的机制。方法:将不同化疗药物联合重组腺病毒载体(Ad)介导的TRAIL基因处理对Ad/gTRAIL耐药的结肠癌DLD1-TRAIL/R细胞,通过MTT法检测治疗后肿瘤细胞的存活率,以评价化疗药物对TRAIL基因耐药的逆转作用;然后进一步在体内评价该逆转策略的有效性;接着通过Western免疫印迹等方法探讨逆转耐药的可能机制。结果:在体外检测了5-氟脲嘧啶、丝裂霉素、阿霉素、氟脲苷、依立替康以及顺铂6种化疗药物对DLD1-TRAIL/R细胞TRAIL基因耐药的逆转作用,结果发现只有5-氟脲嘧啶和丝裂霉素能够使DLD1-TRAIL/R细胞对Ad/gTRAIL重新敏感。进一步的结果表明联合5-氟脲嘧啶和Ad/gTRAIL能在体内有效地抑制DLD1-TRAIL/R细胞来源的肿瘤生长,且该抑制作用明显强于其它对照组。结论:联合使用Ad/gTRAIL和5-氟脲嘧啶或丝裂霉素能在体内外有效地逆转DLD1-TRAIL/R细胞对TRAIL基因的获得性耐药,其中丝裂霉素的逆转作用可能与其诱导的Bax过度表达有关。

表达GFP基因的溶瘤腺病毒对大肠癌细胞的体外杀伤作用

目的:研究在端粒酶启动子驱动下表达绿色荧光蛋白(GFP)及5型腺病毒早期基因(E1A)基因的腺病毒Ad/hTERT-GFP-E1对大肠癌细胞的杀伤作用及其可能的机制。方法:将不同滴度Ad/hTERT-GFP-E1感染大肠癌及正常细胞,以巨细胞病毒(CMV)启动子驱动下表达GFP基因的腺病毒Ad/CMV-GFP作为载体对照,通过半数组织培养感染量(TCID50)法测定病毒滴度及体外复制能力,然后用MTT法及细胞克隆形成试验评价该病毒在体外对肿瘤细胞及正常细胞的杀伤作用,并对病毒感染后的细胞进行原位凋亡检测。结果:Ad/hTERT-GFP-E1能够在DLD1细胞内持续复制,GFP的表达能够对病毒的感染和复制起到监测作用;MTT结果显示该病毒对于结直肠肿瘤细胞有显著杀伤作用,而对于正常细胞没有明显的杀伤作用;对病毒感染后的DLD1进行细胞凋亡检测发现Ad/hTERT-GFP-E1所引起的凋亡率显著高于对照组(P<0.01)。结论:溶瘤腺病毒Ad/hTERT-GFP-E1能够选择性地在肿瘤细胞内复制并杀伤肿瘤细胞,其机制与细胞凋亡的途径有关。

人染色体8p11(CHRNB3-CHRNA6)区域基因多态性与中国汉族人群肺癌易感性的相关性

为探讨人染色体8p11（CHRNB3-CHRNA6）区域基因多态性与中国汉族人群肺癌遗传易感性之间的关系,文章采用病例-对照研究,对784例肺癌患者和782例性别、年龄、籍贯频数与之相匹配的健康对照中该区域6个标签SNP位点进行基因分型,并统计分析其基因型频率分布与肺癌易感性的关系,以及吸烟在其中的影响。结果发现rs16891561位点TT基因型在60岁以上人群（校正OR=0.42,95%CI=0.20-0.88;P=0.022）、女性人群（校正OR=0.34,95%CI=0.13-0.87;P=0.025）、非吸烟人群中（校正OR=0.32,95%CI=0.13-0.79;P=0.013）对肺癌发生具有保护效应;rs4236926位点TT基因型在60岁以上人群（校正OR=0.48,95%CI=0.23-0.99;P=0.048）、非吸烟人群（校正OR=0.32,95%CI=0.13-0.80;P=0.014）中对肺癌发生具有保护效应,这两种保护效应主要是与腺癌相关。对这两个位点进行累积效应分析发现,含有3-4个变异等位基因型的非吸烟者罹患肺癌的风险显著降低（校正OR=0.29,95%CI=0.11-0.71;P=0.007）,并且,含有3-4个变异等位基因型的个体累计吸烟量（＂包-年＂平均数=13.2）与其他个体相比显著降低。由此可见人染色体8p11（CHRNB3-CHRNA6）区域基因多态性与中国汉族人群肺癌易感性和吸烟行为相关。