2023年γδT细胞肿瘤治疗领域重大进展

γδT细胞是一类表达γδTCR异源二聚体的特殊固有免疫T细胞。过去,缺乏对其全面系统的基础研究,在其发育、分化、增殖、活化、效应和耗竭等所有环节仍有很多问题尚不清楚。然而,因为成熟的γδT细胞优势定植于皮肤、消化道、呼吸道、生殖道等肿瘤高发的黏膜组织,能以MHC非限制性的方式直接识别和杀伤多种肿瘤细胞,在肿瘤免疫治疗领域具有不可替代的优势,近年来其应用异军突起,发展迅速,也因此反过来促进了基础研究的深入,取得了一些亮眼的进展。本文对2023年γδT细胞在肿瘤免疫治疗领域的重大进展进行述评,主要集中在γδT细胞肿瘤抗原识别机制、肿瘤微环境中γδT细胞的功能调控、γδT细胞抗肿瘤细胞毒活性的机制、新型基于γδT细胞的肿瘤免疫治疗协同增效策略四个方面,以期推动γδT细胞在肿瘤免疫治疗领域的进一步发展,为临床γδT细胞应用协同增效的策略提供新的思路。

靶向BCMA的CAR-γδT细胞抗多发性骨髓瘤的疗效

目的构建靶向B细胞成熟抗原(BCMA)的嵌合抗原受体γδT细胞(BCMA CAR-γδT),在体外初步评价其抗多发性骨髓瘤的疗效。方法构建包含BCMA单链抗体序列的三代CAR分子的慢病毒载体,瞬时转染293T细胞,荧光显微镜和Western blot验证外源基因的表达情况;包装慢病毒,用流式细胞术测定病毒滴度;分别感染人外周血αβT细胞和γδT细胞,检测感染效率;LDH法检测BCMA CAR-γδT细胞对人多发性骨髓瘤细胞系的体外细胞毒活性,并用Incucyte实时细胞分析系统比较BCMA CAR-γδT细胞与BCMA CAR-T细胞的细胞毒活性差异。结果将BCMA-CAR慢病毒载体转入293T细胞24 h后,荧光显微镜观察到外源ZsGreen的表达;Western blot检测CD3ζ证明BCMA-CAR能顺利表达。慢病毒包装后,收集感染上清浓缩,测得病毒滴度为2.23×10^(8)Tu/mL。用MOI=5感染人外周血αβT细胞与γδT细胞,流式检测结果显示αβT细胞感染效率为59.18%±2.56%,γδT细胞感染效率为48.15%±9.86%。LDH杀伤实验结果显示,CAR-γδT细胞对BCMA高表达的人骨髓瘤细胞系MM1.S、H929和过表达BCMA的K562细胞的细胞毒活性较空载体对照γδT细胞显著增强(P<0.001),而对BCMA表达阴性的细胞系无差异;活细胞时程分析系统结果显示,BCMA CAR-γδT细胞与BCMA CAR-αβT细胞在体外对H929的细胞毒活性均显著优于其空载体对照细胞,且均对BCMA表达阴性的细胞系的细胞毒活性无差异。结论BCMA CAR-γδT细胞在体外显示出明显增强的靶向BCMA的细胞毒活性,有望作为新型同种异体γδT细胞产品,用于多发性骨髓瘤的细胞过继免疫治疗。

过表达膜定位IL-3的293T细胞外泌体的纯化及体外功能验证

目的体外验证过表达膜定位IL-3的293T细胞外泌体的功能,为在阿尔茨海默病模型动物的体内功能验证奠定基础。方法利用本课题组的专利结构,构建能定位于外泌体膜上的重组IL-3慢病毒载体,包装病毒感染293T细胞,筛选稳定表达细胞株。用流式细胞测量术和免疫荧光技术对IL-3的膜定位进行验证;超滤离心纯化IL-3外泌体,透射电镜观察外泌体形态;纳米流式测量术检测外泌体粒径分布及浓度;Western blot检测IL-3及外泌体相关标志蛋白质表达;免疫荧光技术检测其对小胶质细胞系BV-2吞噬Aβ淀粉样蛋白能力的影响。结果经过载体构建、病毒感染、嘌呤霉素筛选和验证,得到稳定过表达膜定位IL-3的293T细胞株;收集纯化外泌体,在透射电镜下可见直径50~100 nm的双层膜囊泡结构;免疫印迹结果显示CD63、ALIX、TSG101等多种外泌体标志蛋白质检测阳性,且与对照相比富含IL-3,提示IL-3外泌体纯化成功;免疫荧光技术检测结果显示IL-3外泌体能在体外促进BV-2细胞对Aβ淀粉样蛋白的吞噬作用。结论过表达膜定位IL-3的基因修饰293T细胞外泌体在体外兼具IL-3和外泌体的作用,能够促进小胶质细胞的吞噬作用,为阿尔茨海默病的临床治疗提供新的思路。

风湿性关节炎患者T细胞表达CCR5和CXCR3的三色流式细胞分析

目的 在单细胞水平上，研究类风湿性关节炎（ＲＡ）患者滑液及外周血中Ｔ淋巴细胞上ＣＣＲ５及ＣＸＣＲ３的表达，并结合临床资料分析其在ＲＡ发病中的可能作用机制及临床应用。方法 分离１５例ＲＡ患者的滑液单个核细胞（ＳＦＭＣ）、外周血单个核细胞（ＰＢＭＣ），及１５正常人ＰＢＭＣ（对照），以三色荧光素标记物进行流式细胞术分析Ｔ细胞上ＣＣＲ５及ＣＸＣＲ３的表达。结果 与ＰＢＭＣ相比较，ＲＡ患者ＳＦＭＣ中Ｔ细胞上ＣＣＲ５及ＣＸＣＲ３的表达显著增高（特别是ＣＣＲ５）；而ＣＸＣＲ３的表达个体差异较大；与正常人相比较，ＲＡ患者初发或活动期未治时，ＰＢＭＣ中ＣＣＲ５及ＣＸＣＲ３的表达明显增多。 ＣＣＲ５及ＣＸＣＲ３的表达率与患者的ＥＳＲ及ＣＲＰ相关。结论 ＣＣＲ５＋Ｔ细胞积聚在ＲＡ患者的病变关节内，且与ＲＡ的病情密切相关。

HLA-A2限制性NY-ESO-1b肽段诱导的CD8^+T细胞对稳定表达NY-ESO-1的HepG2肝癌细胞系的杀伤效应

目的分析体外诱导的NY-ESO-1特异性杀伤性T淋巴细胞对稳定表达NY-ESO-1蛋白的肝细胞性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)细胞系的杀伤效应,为进一步分析NY-ESO-1蛋白作为疫苗用于治疗HCC的可能性提供实验支持。方法从HLA-A2阳性的肝癌患者体内分离出外周血单个核细胞,用NY-ESO-1肽段体外诱导特异性杀伤性T淋巴细胞,并通过酶联免疫斑点法分析特异性杀伤性T淋巴细胞对稳定表达NY-ESO-1蛋白的HCC细胞系HepG2细胞的杀伤效应。结果转染了NY-ESO-1的HepG2细胞(HLA-A2+)可有效地被NY-ESO-1157-165抗原肽诱导的特异性CD8+T淋巴细胞所识别。效应细胞中大量GrB的释放表明其对稳定转染了NY-ESO-1基因的HepG2细胞有很强的杀伤作用。结论HepG2细胞中表达的NY-ESO-1蛋白可被此肝癌细胞有效地加工处理,而且HLA-A2限制性的抗原肽NY-ESO-1157-165也可被有效地提呈到细胞表面,从而被效应T细胞所识别。

基因芯片筛选稳定转染FATE/BJ-HCC-2基因的肝癌细胞中肿瘤转移相关差异表达基因

目的筛选稳定转染FATE/BJ-HCC-2基因的肝癌细胞中肿瘤转移相关的差异表达基因。方法分别提取稳定转染FATE/BJ-HCC-2的肝癌细胞(5B4)及转染空质粒的对照细胞(Mock)总RNA,通过基因芯片技术筛选差异表达基因。结果与Mock细胞比较,5B4细胞共筛选出1 694个差异表达基因,有11个基因表达差异明显,其中MMP-1、PTGS2、FN、CA9、IL-8、ILK、Areg 7个基因在转染FATE/BJ-HCC-2基因后表达量明显上升,差异倍数分别为81.80、49.86、11.30、16.26,3.48、2.79、2.20。E-cadherin、RhoBTB3、ALPP、HLA-DRB 4个基因表达量明显下降,差异倍数分别为-5.42、-2.23、-5.93、-8.03。结论采用基因芯片技术对FATE/BJ-HCC-2参与的肝癌转移的差异表达基因进行细致的筛选,其最终目的是为研究肝癌转移机制打下坚实的理论基础。

强力霉素抑制丝裂霉素诱导的MTEC1细胞凋亡及其蛋白质组初步分析

目的:探讨强力霉素(doxycycline,Dox)保护胸腺上皮细胞的作用及其机制,为进一步研究Dox的免疫调节作用奠定基础。方法:利用光学显微镜观察Dox对丝裂霉素(mitomycin,MMC)诱导MTEC1凋亡的影响,同时采用Hochest33342、PI单染、Annexin V和PI双染确认其作用,最后利用表面加强激光解析电离飞行时间质谱技术分析了SAX2芯片捕获的Dox作用前后的差异蛋白质。结果:通过形态学观察、Hochest33342、PI单染及Annexin V和PI双染发现Dox确实能保护MTEC1抵抗丝裂霉素诱导的细胞凋亡。随后采用表面加强激光解析电离飞行时间质谱技术分析SAX2芯片捕获蛋白,发现Dox能调控15种蛋白,其中上调8种,下调7种。结论:Dox具有保护MTEC1,抑制MMC诱导的细胞凋亡作用,并对MTEC1的蛋白表达有调控作用。

沉默FATE/BJ-HCC-2基因的表达对肝癌细胞迁移及侵袭的影响

目的:研究FATE/BJ-HCC-2基因表达与肝癌细胞迁移及侵袭的关系。方法:体外合成FATE/BJ-HCC-2基因序列特异性小干扰RNA(siRNA),转染肝癌细胞系克隆株5B4,并设非特异性siRNA转染和空白对照组。采用RT-PCR及Western blot方法检测各组细胞中FATE/BJ-HCC-2 mRNA和蛋白的表达;通过Transwell小室模型检测各组细胞体外迁移及侵袭的能力;激光共聚焦显微镜下观察5B4及空质粒转染的对照细胞(Mock)的骨架结构。结果:各组细胞中FATE/BJ-HCC-2 mRNA和蛋白表达差异有统计学意义(F=15.321,P=0.020),特异性siRNA转染组细胞低于其他2组(P<0.05)。抑制FATE/BJ-HCC-2基因表达后,细胞体外迁移及侵袭的能力降低(F=6.171和10.109,P<0.05)。5B4细胞形态拉长,蝌蚪状,呈现迁移、游走的状态;微丝丰富,形态规则,平行贯穿于细胞全长,细胞膜周围有较多丝状伪足伸出;微管减少,分布不规则。结论:FATE/BJ-HCC-2基因表达促进肝癌细胞的迁移及侵袭。

TCRαβ^+CD4^+CD8^-胸腺髓质细胞的表型分析

本实验综合分析了CD4^+CD8^-胸腺髓质细胞多种表面分子的表达情况。通过抗体加补体的2次杀伤和panning方法,分离出CD4^+CD8^-胸腺髓质细胞,进行直接或间接荧光抗体染色,利用流式细胞仪分析细胞表型。发现CD4^+CD8^-胸腺细胞均为TCRαβ阳性,但CD69,HSA,Qa-2,3G11,6C10分子呈现异质性表达。利用多个表面分子组合进行双染FACS分析,推测CD4SP胸腺细胞由不成熟到发育成熟,迁出胸腺,可分为7个阶段:(1)3G11^-6C10^+CD69^+HSA^(hi),(2)3G11^+6C10^+CD69^+HSA^(hi),(3)3G11^+6C10^-CD69^+HSA^(int),(4)3G11^+6C10^-CD69^-HSA^(int)Qa-2^-,(5)3G11^+HSA^(lo/-)Qa-2^(lo),4阶段还可进一步分化为(6) 3G11^-HSA^(lo)Qa-2^-,(7) 3G11^-HSA^(lo/-)Qa-2^(hi)。Qa-2^+的5,7两阶段细胞已达到最终成熟,并可迁出胸腺。

细胞治疗技术分类和发展历程

细胞治疗是利用患者自体(或同种异体)的细胞,对组织、器官进行修复的治疗方法。然而因为细胞是一个成分复杂、精细调控的活的有机整体,要将其用作药物面临着很大的挑战。因此细胞治疗虽有百年历史,但直到2017年第一个嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)疗法获批上市,才标志着现代医学进入细胞治疗时代。细胞治疗主要包括干细胞治疗和免疫细胞治疗。干细胞应用广泛,不同来源的干细胞产品为多种神经系统、免疫系统相关复杂难治的疾病的治疗提供了有效途径。随着CAR-T细胞疗法在肿瘤免疫治疗中的成功,多种免疫细胞治疗技术得到了迅猛发展,成为恶性肿瘤治疗领域的研究热点,并逐渐扩大到其他的疾病治疗领域。近年来我国在细胞治疗领域研发水平取得了长足的发展,然而这些细胞治疗技术仍面临着诸多挑战。与传统分子药物比较,细胞治疗是一种高技术型的创新性疾病治疗方案,本文对整个细胞治疗技术的分类、发展历程和最新的研究进展及挑战进行综述,希望能为整个行业的快速发展提供助力。

一种小鼠胸腺基质细胞和活化胸腺细胞共表达分子的研究

目的 :研究抗小鼠胸腺基质细胞 (MTSC)Pf18 3单抗识别分子的表达特性。方法 :采用流式细胞 (FACS)和激光扫描共焦显微镜 (CLSM)分析TSC单抗Pf18 3染色特征。结果 :FACS分析发现Pf18 3单抗识别分子可表达于胸腺、胎肝和骨髓等不同来源的基质细胞系和腹腔巨噬细胞表面。新鲜分离的胸腺细胞Pf18 3识别分子表达阴性 ,但ConA活化可诱导并上调其表达 ,随活化时间延长表达增高 ,且主要表达于CD4+CD8+和CD4+CD8-两细胞亚群。CLSM分析可见 :荧光沿胸腺细胞边缘呈环状分布 ,活化后荧光明显增厚向胞浆延伸 ,胞核不着色。结论 :Pf18 3单抗识别分子共表达于胸腺基质细胞及活化的胸腺细胞 。

抑制消减杂交法筛选原发性肝细胞癌中差异表达的基因及其生物学意义

为了筛选原发性肝细胞癌 (hepatocellularcarcinoma ,HCC)中差异表达的基因 ,以了解HCC发生发展的分子基础 ,选取了一例早期高分化肝癌标本作为材料 ,采用抑制消减杂交 (suppressionsubtractivehybridization ,SSH)技术 ,进行了前向及反向消减杂交 ,结合反向Northern印迹筛选 ,得到多个差异表达的基因 .对有意义的基因用半定量RT PCR检测了肝癌中的表达 .结果显示 ,PON2、hSRP1alpha、H4 1在大部分肝癌中表达升高 ,IGFBP1、ITIH1在早期癌症中 ,大部分癌的表达升高 ,在晚期癌症中则表达下降 .EGR1在大部分肝癌中表达降低 .研究表明 ,不同分化程度、不同临床分期的肝癌 ,有共同的或不同的基因表达发生改变 ,明确这些差异表达的基因谱 ,对于肝癌发生发展机理的阐明及肝癌的预防、诊断、治疗都有重要意义 .

肿瘤相关抗原CHP2促进HEK293细胞在裸鼠腹腔内的转移

目的:研究肿瘤相关抗原CHP2对HEK293细胞在裸鼠腹腔内转移能力的影响,并初步探讨其可能的分子机制。方法:通过Boyden小室法检测CHP2转染细胞和对照细胞的体外转移能力。对BALB/c裸鼠进行腹腔接种,观察裸鼠体内的成瘤与组织浸润情况并进行HE染色。利用RT-PCR方法检测HEK293细胞中部分转移相关分子的基因表达水平。结果:CHP2增强HEK293细胞在体外穿过Matrigel胶的侵袭能力,同时显著加速HEK293细胞在裸鼠腹腔内的成瘤速度并促进肿瘤对腹腔主要脏器的浸润。CHP2上调转移相关分子骨桥蛋白(osteopon-tin,OPN)在HEK293细胞中的表达,但对基质金属蛋白酶MMP2的表达没有明显影响。结论:CHP2显著增强HEK293细胞在体外及裸鼠腹腔内的转移能力,OPN表达上调可能参与CHP2对HEK293细胞的转移促进作用。

凝集素美洲商陆对人单核细胞及白血病细胞的HLA－DR分子表达的影响

通过流式细胞仪的方法，报道了凝集素美洲商陆（ＰＷＭ）对人单核细胞和白血病细胞表面的ＨＬＡ－ＤＲ分子表达的影响。实验结果显示：ＰＷＭ可以直接与单核细胞和白血病Ｕ９３７细胞及Ｒａｊｉ细胞相结合，而且这３种细胞均表达ＨＬＡ－ＤＲ分子。经ＰＷＭ处理２４ｈ后，正常人单核细胞ＨＬＡ－ＤＲ分子的表达不受影响，而Ｕ９３７细胞和Ｒａｊｉ细胞上的ＨＬＡ－ＤＲ分子均被下调，而且这种下调作用与ＰＷＭ的剂量有关。其他凝集素，如ＰＨＡ、ＷＧＡ和内毒素ＬＰＳ对白血病细胞ＨＬＡ－ＤＲ分子的表达无影响。结果表明，通过凝集素ＰＷＭ的处理可以改变肿瘤细胞表面ＭＨＣⅡ类分子的表达，从而为肿瘤免疫治疗提供新的途径。

癌基因与抗癌基因和细胞程序性死亡及肿瘤的发生与控制

癌基因与抗癌基因和细胞程序性死亡及肿瘤的发生与控制大连医科大学病理生理学教研室（１１６０２３）董海东，钱振超癌基因和抗癌基因的相继发现大大加深了人们对肿瘤发病学的认识。癌基因和抗癌基因不仅调节和控制肿瘤细胞的增殖、分化和转移，而且也调节肿瘤细胞的程序...

肺癌患者外周血BJ-TSA-9,LUNX和CK19 mRNA的检测及其临床意义

目的观察肺癌患者外周血循环中BJ-TSA-9,LUNX和CK19mRNA的表达情况,并探讨BJ-TSA-9,LUNX和CK19mRNA联合检测的临床意义。方法采用巢式逆转录聚合酶链反应(Nested-RT-PCR)技术检测84例肺癌患者、32例肺良性病变患者和20例健康人。结果肺癌患者外周血中BJ-TSA-9,LUNX和CK19mRNA阳性率分别为59.5%,40.4%和22.6%。32例良性病变者外周血中BJ-TSA-9,LUNX和CK19mRNA阳性率分别为9.3%,12.5%和6.3%。20例健康志愿者外周血中无BJ-TSA-9,LUNX和CK19mRNA表达。Ⅳ期肺癌患者BJ-TSA-9,LUNX和CK19mRNA阳性率明显高于Ⅱ期和Ⅲ期(P<0.05)。结论BJ-TSA-9,LUNX和CK19mRNA均可作为RT-PCR法检测肺癌患者外周血微转移的肿瘤标志物。BJ-TSA-9mRNA在有效率上优于LUNXmRNA和CK19mRNA,肺癌患者外周血中检测出BJ-TSA-9mRNA提示可能有血循环转移。

胸腺细胞的选择与程序性细胞死亡

胸腺通过阳性和阴性选择作用，保留有功能的并对自身耐受的T细胞，同时通过启动程序性细胞死亡（programmedcelldeath，PCD）机制消除无功能的或对自身有反应性的T细胞。参与胸腺细胞PCD调节的因素中包括胸腺基质细胞和膜分子的作用。胸腺内细胞发生PCD的机理十分复杂。本文从两种选择中PCD出现的特点，PCD与选择作用之间的关系，以及在T细胞耐受形成中PCD的作用等方面，在细胞和分子水平上描述当前这一领域中的研究进展，并提出了若干仍需解决的关键问题。

肿瘤抑制基因PTEN的研究进展

评述了PTEN作为一个重要的肿瘤抑制基因 ,在功能、表达调控机制及与同源基因的关系等方面的最新研究进展 .PTEN不仅有脂质磷酸酶活性 ,还有蛋白磷酸酶活性 .通过这两种活性 ,PTEN调节细胞的生长、增殖、迁移与凋亡 ;PTEN基因和蛋白的表达被包括 p5 3,Egr 1 ,PPARγ与Sp1在内的多种因子调控 ;PTEN的同源基因PTEN 2是一种肿瘤睾丸抗原基因 ,在肝癌与肺癌中表达 。

细胞因子与淋巴细胞激活

细胞因子与淋巴细胞激活董海东，陈静，陈慰峰（北京医科大学免疫学系Ｔ细胞室，北京１０００８３）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎｉｍｍｕｎｏｃｙｔｅｓｐｒｏｄｕｃｅｖａｒｉｏｕｓｋｉｎｄｓｏｆｃｙｔｏｋｉｎｅｓｗｈｉｃｈｐｌａｙｖｅｒｙｉｍｐｏ...

急性T淋巴细胞白血病患者NOTCH1与FBXW7基因突变特征及对预后的影响

目的分析急性T淋巴细胞白血病(T-ALL)患者NOTCH1与FBXW7基因突变特征及其临床特点对预后的影响。方法回顾性分析2016年3月至2021年3月河南省人民医院有二代基因测序数据的61例T-ALL患者的临床资料,包括男46例,女15例,年龄[M(Q_(1),Q_(3))]为18(11,30)岁。分析T-ALL患者NOTCH1/FBXW7基因突变特征与临床和实验室参数的关系,以及其对无事件生存期(EFS)和总生存期(OS)的影响。结果共34例(55.7%,34/61)患者检出NOTCH1基因突变,其中异二聚体结构域(HD)突变22例(64.7%),脯氨酸/谷氨酸/丝氨酸/苏氨酸结构域(PEST)突变7例(20.6%),同时存在HD与PEST突变5例(14.7%)。9例(14.8%,9/61)患者检出FBXW7基因突变,其中5例同时存在NOTCH1和FBXW7突变。23例(37.7%,23/61)患者为野生型。NOTCH1/FBXW7基因突变组患者与野生型组患者外周血白细胞数量[M(Q_(1),Q_(3))]分别为76.4×10^(9)/L(8.3×10^(9)/L,149.2×10^(9)/L)、54.1×10^(9)/L(5.3×10^(9)/L,156.6×10^(9)/L),血红蛋白水平分别为(89.1±27.1)、(99.5±23.1)g/L,骨髓原始细胞比例[M(Q_(1),Q_(3))]分别为84.5%(69.0%,91.3%)、60.0%(35.0%,80.0%),SIL-TAL1、HOX11、HOX11L2基因表达率分别为7.9%(3/38)比17.4%(4/23)、18.4%(7/38)比4.3%(1/23)、5.3%(2/38)比13.0%(3/23),差异均无统计学意义(均P>0.05);但NOTCH1/FBXW7基因突变组患者血小板水平[M(Q_(1),Q_(3))]为60.5×10^(9)/L(36.8×10^(9)/L,100.3×10^(9)/L),低于野生型组患者的116.0×10^(9)/L(63.0×10^(9)/L,178.0×10^(9)/L)(P=0.018)。伴NOTCH1/FBXW7基因突变组患者的基因突变个数[M(Q_(1),Q_(3))]为2.5(1.8,4.0)个,高于NOTCH1/FBXW7野生型组的0(0,1.0)个(P<0.001)。成人NOTCH1/FBXW7基因突变组患者的中位EFS和OS分别为28.0个月(95%CI:7.3~48.7个月)、30.0个月(95%CI:8.9~51.1个月),均优于成人野生型组患者的4.5个月(95%CI:0~11.6个月)、9.0个月(95%CI:0~19.1个月)(P=0.008、0.014);而儿童NOTCH1/FBXW7基因突变组中位EFS和OS分别为12.0个月(95%CI:10.4~13.6个月)、19.0个月(95%CI:13.6~24.4个月),儿童野生型组分别为10.0个月(95%CI:8.9~11.1个月)、21.0个月(95%CI:0~51.4个月),差异均无统计学意义(P=0.673、0.434)。结论T-ALL患者NOTCH1/FBXW7基因突变率较高,NOTCH1/FBXW7基因突变组患者血小板计数减低,且具有较好的EFS和OS,NOTCH1/FBXW7基因突变可能作为成人T-ALL患者个体化治疗的一个分层依据。