胶原膜用于血管内基因投递的实验研究

目的评价胶原膜上通过抗体结合腺病毒或质粒DNA作为基因投递载体的可行性及效果。方法采用交联剂N-琥珀酰亚胺基3-（2-吡啶二硫基）丙酸酯（SPDP）将抗腺病毒或抗DNA抗体共价键结合在胶原膜上,通过这些抗体将腺病毒载体（Ad-GFP）和质粒DNA（pEGFP-C1）结合在膜上。采用同位素标记的质粒DNA（pDNA）在体外测定基因的释放,用细胞转染试验评价这种新型基因递送体系的功能。结果通过SPDP交联剂成功地将抗体共价键连接在胶原膜上,并结合了表达绿色荧光蛋白（GFP）的腺病毒和质粒DNA。细胞实验发现胶原膜上有大量表达GFP的阳性细胞,而膜以外的区域则没有GFP阳性细胞,表明具有局部递送特征。偶联Ad-GFP的胶原膜最大转染效率达到92.8%,而且在10^7-10^10病毒粒子/mL范围内,转染效率呈正剂量相关性。偶联pEGFP-C1的胶原膜诱导的细胞转染效率约为21.8%,结合32P标记的pDNA的胶原膜体外基因释放持续13天以上。用胶原涂层的不锈钢血管支架进行了同样的试验,在细胞培养中支架表面有大量GFP阳性细胞,其他区域没有GFP阳性细胞。结论胶原膜携带抗体偶联基因是一种新型的基因投递体系,可实现高效和局部定位的基因转染。

抗体/腺病毒复合物为载体的基因定位递送

临床基因治疗方案中基因载体在疾病部位的靶向递送仍是急待解决的问题。本研究将腺病毒与一种生物素化的特异性抗腺病毒六邻体的多克隆IgG结合,固定于结合了亲和素的胶原蛋白膜上,成功获得腺病毒载体基因靶向定位递送体系。体外稳定性研究结果表明该体系中病毒载体可有效保持活性。通过这种特异性抗体偶联方式,将携带单纯疱疹胸苷激酶(HSVtk)编码基因片断的腺病毒结合在胶原膜上转染大鼠平滑肌细胞(A10),加入更昔洛韦(ganciclovir)后,只有生长在胶原膜上及膜邻近50μm内的细胞被杀死。在使用非特异性抗体的对照实验中,整个培养基范围内的细胞几乎全被杀死。以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因对猪的心肌进行转基因实验,结果显示注射特异性抗体偶联病毒的胶原凝胶比直接注射病毒悬液获得更高效的心室基因表达。所有研究结果表明,通过生物素和特异性抗体使病毒载体固定在胶原蛋白基质上,可达到有效的局部定位基因表达,避免向非病灶部位的扩散,是基因治疗中一种极具发展潜力的载体定位递送方法。