禽流感病毒H5N1血凝素蛋白的重组牛痘病毒表达

目的研究H5 I151F和H5 I151F＋A134V＋E186D两种氨基酸变异对血凝素蛋白（HA）亲人受体结合的影响，并获得该HA。方法构建载体pRB21’，共感染／转染vp37^-牛痘病毒vRB12和pRB21’，基因同源重组牛痘病毒表达HA，Western免疫印迹法鉴定。结果获得了克隆有H5HA全长基因片段的载体pRB21’，构建了2种重组牛痘病毒re-VV H5 I151F和re-VV H5 I151F＋A134V＋E186D，且能在被感染细胞膜表达这两种HA。结论首次通过构建重组牛痘病毒成功表达了禽流感病毒H5N1的H5HA，为进一步研究禽流感病毒人传人的可能性奠定了基础。

禽流感病毒H5N1基因突变对神经氨酸酶抑制剂敏感性和神经氨酸酶活性的影响

目的 研究感染人的禽流感病毒H5N1神经氨酸酶突变I117V,I314V,I117V＋I314V对神经氨酸酶抑制剂（NAIs）敏感性和神经氨酸酶（NA）活性的影响.方法 定点突变技术将变异位点引入禽流感病毒株A/Vietnam/1203/04（H5N1）（VN1203）的NA基因中,以A/WSN/33（H1N1）为背景,通过反向遗传学方法构建重组流感病毒,鸡胚传代增殖病毒,荧光定量评估病毒对NAIs的敏感性和NA活性（IC50值和Km,Ki值）.结果 与野生株VN1203相比,I117V使NA对奥司他韦敏感性降低（IC50值升高了17倍,Ki值升高了20倍）,对扎那米韦敏感性无明显影响（IC50值升高了2倍,Ki值升高了3倍）,NA活性降低（Km值升高了23倍）.I314V对NAIs敏感性和NA活性均无明显影响.结论 初步结果认为NA突变I117V和I314V对感染人的禽流感病毒H5N1并不产生NAIs耐药,临床上仍然可以用奥司他韦或扎那米韦抗病毒治疗.

禽流感病毒H5N1血凝素蛋白的细胞膜上提纯和结晶

目的从细胞膜上提纯禽流感病毒H5N1的血凝素蛋白H51151F和H51151F＋A134V＋E186D，并使蛋白结晶。方法细胞内大量增殖重组牛痘病毒，去垢剂提取细胞膜中的HA蛋白，连续蔗糖密度梯度超速离心，Western印迹检测，菠萝蛋白酶等裂解HA，离子交换层析，SDS—PAGE电泳并染色检测蛋白纯度，坐滴气象扩散法结晶。结果从细胞膜中提取了高纯度的血凝素蛋白H51151F和H51151F＋A134V＋E186D，并得到了H51151F蛋白晶体。结论首次获得了禽流感病毒H5N1的I-IS1151F蛋白晶体，为进一步研究禽流感病毒人传人的可能性打下基础。