欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒GD2022株的分离鉴定及遗传进化分析

为了解广东省欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV-1)流行情况,将RT-PCR检测PRRSV-1阳性的病料(肺脏和淋巴结)接种猪肺泡巨噬细胞(PAMs)进行病原分离鉴定,以分离毒株核酸作为模板,对分离的PRRSV-1进行全基因克隆和测序,并与国内外PRRSV-1和PRRSV-2参考毒株序列进行同源性及遗传进化分析。结果显示,成功分离1株PRRSV-1,命名为GD2022株,其接种PAMs可引起典型的细胞病变,从出现病变的F5细胞中提取核酸,用PCR分段扩增出PRRSV-1 GD2022株10个基因组片段,分别连接到pCE2 TA/Blunt-Zero载体进行测序,拼接后获得PRRSV-1 GD2022株全基因组长15058个核苷酸(不包含polyA尾)。同源性分析显示,该分离株全基因组序列与PRRSV-1参考毒株(LV株)和PRRSV-2参考毒株(VR2333株)核苷酸序列同源性分别为87%和59.7%。遗传进化树分析显示,全基因序列和ORF5基因与国内外PRRSV-1毒株为同一进化分支,且与疫苗毒分支较远,推断分离株为1株PRRSV-1,属于基因亚型1。氨基酸序列比对分析显示,ORF3和ORF4重叠区域缺失3个核苷酸,导致GP3蛋白和GP4蛋白分别在第245和第65氨基酸位点缺失了1个氨基酸,且与LV株比对,GD2022毒株GP5的氨基酸序列在中和抗原表位第33氨基酸位点(D→A)出现点突变,在高变区第56氨基酸位点(D→A)和第63氨基酸位点(G→D)出现两处突变。重组分析显示,GD2022毒株未发生重组事件。成功分离鉴定1株PRRSV-1毒株,为国内PRRSV-1生物学特性研究提供了材料,也为了解广东省内PRRSV-1流行情况及变异特点提供参考依据。

禽致病性大肠埃希氏菌生物被膜形成的调控机制研究进展

禽致病性大肠埃希氏菌能够引起禽类感染性细菌病,给禽类养殖业造成了重大的经济损失,并严重限制了禽类养殖业的健康发展。为了了解禽致病性大肠埃希氏菌的感染机制,论文简述了生物被膜的形成过程及其危害。细菌生物被膜的形成不但增强细菌对抗菌药物的耐药性,而且导致宿主持续和反复性感染,同时还很难被预防、控制和清除。论文还分析了普遍存在于各类细菌中的重要调控系统——群体感应、双组份系统和第二信使的信号转导途径及其调控机制,并阐述了群体感应、双组份系统和第二信使以及两系统间的互作网络对细菌生物被膜的影响。因此,了解多系统共同调控生物被膜形成的分子机制或许可以作为破坏生物被膜形成的新策略,从而为控制由生物被膜引起的感染和抗菌药物耐药性提供研究方向。

羊源多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及药敏试验

为确定陕西某规模化奶山羊场部分羊出现精神沉郁,食欲减退,采食量减少,呼吸困难甚至出现死亡的病因,以病羊病变组织为研究对象,采用细菌分离培养、生化试验、16S rRNA PCR扩增测序、药敏试验、致病性试验等方法对分离菌株进行鉴定和分析。结果显示,从病死羊肝脏组织中分离到1株革兰氏阴性、无芽孢、无鞭毛且两极浓染的短杆菌,在TSA培养基上呈现出贫瘠的细小、透明、露滴状菌落;在麦康凯培养基上不生长;在血琼脂平板上长出灰白色、圆形、光滑、湿润、不透明的露滴样菌落;分离菌株能分解葡萄糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、触酶、鸟氨酸脱羧酶,不能分解麦芽糖、乳糖、吲哚、枸橼酸盐、硫化氢、尿素、甲基红反应,与多杀性巴氏杆菌生化特性基本一致;分离菌株16S rRNA序列与GenBank中登录的多杀性巴氏杆菌的16S rRNA相似性达99.9%以上;分离菌对羧苄西林、哌拉西林、头孢唑林、头孢他啶、头孢曲松、头孢哌酮、庆大霉素等抗菌药敏感,对青霉素、苯唑西林、氨苄西林、头孢氨苄、头孢拉定、四环素、多西环素、红霉素等抗菌药耐药;致病性试验结果显示,在24 h内攻毒小鼠全部死亡,说明分离菌有较强的致病力。研究结果丰富了羊多杀性巴氏杆菌的流行病学资料,并为该病的防治提供了参考。

非洲猪瘟病毒I177L蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

为了制备抗非洲猪瘟病毒I177L蛋白的多克隆抗体,根据HLJ/2018株的I177L序列,设计引物,扩增带有His标签序列的I177L序列,并将其插入pMAL-c5x原核表达载体中,转化至Rosetta(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导表达和切胶纯化后,用Xa蛋白酶因子去除重组蛋白中的MBP标签。将处理后的I177L蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体。结果显示,在37℃、0.6 mmol/L IPTG条件下,诱导5 h后,重组MBP-I177L蛋白表达量最高,蛋白分子质量大小约为67 ku,与预期大小相符;重组蛋白以可溶性表达为主;多克隆抗体经Western blot、间接ELISA及IFA试验结果显示,抗体效价为1∶128000,并且该抗体能特异性识别I177L蛋白。

秦岭大熊猫骨髓、牙髓和脂肪组织来源间充质干细胞的分离与鉴定

大熊猫是世界生物多样性保护的旗舰物种,秦岭大熊猫是大熊猫的重要亚种种群。间充质干细胞(MSCs)是细胞治疗领域中的理想种子细胞,是大熊猫极具保护价值的种质资源。通过组织块法和胶原酶消化法处理幼龄秦岭大熊猫骨髓、牙髓和脂肪组织后,获得了各组织来源的细胞,其形态均呈长梭形,在细胞融合度达90%时均表现出漩涡状生长状态,传至第10代时增殖能力减弱;3种来源的细胞均表达MSCs的特异性标志物CD73和CD90,不表达造血干细胞的特异性标志物CD31和CD34,其中骨髓来源细胞还表达其特异性标志物SOX-2和SCFR,牙髓来源细胞表达SCFR脂肪来源细胞表达GNL3;诱导分化结果显示,各组织来源的细胞均能分化为成脂细胞、成骨细胞和成软骨细胞。表明获得了秦岭大熊猫骨髓、牙髓和脂肪组织来源MSCs。

温洲地区部分奶牛场隐孢子虫种类与分布调查

为阐明浙江省温州地区奶牛隐孢子虫感染情况及其种类分布,对地处温州市的乐清市、瑞安市和平阳县的3个奶牛场85份新鲜荷斯坦奶牛粪便样品进行DNA提取,并基于隐孢子虫小亚基核糖体核苷酸(SSU rRNA)基因位点设计特异扩增引物,进行隐孢子虫PCR扩增、测序和序列分析。结果显示,3个奶牛场奶牛隐孢子虫的总感染率为34.1%(29/85),其中,平阳县感染率最高,达42.6%(20/47);在不同年龄段奶牛中,断奶前犊牛感染率最高,达64.3%(18/28)。共检出4种隐孢子虫,分别为牛隐孢子虫(Cryptosporidium bovis)、瑞氏隐孢子虫(C.ryanae)、安氏隐孢子虫(C.andersoni)和奇异隐孢子虫(C.occultus),且在29份阳性样品中,C.bovis的占比最高(34.5%,10/29),分布范围最广,成为该地区奶牛感染隐孢子虫的优势虫种。结果提示,温洲地区奶牛隐孢子虫感染较为普遍,且种类较多。研究结果可为该地区奶牛隐孢子虫病的防控提供基础数据。

塞内卡病毒3D蛋白的截短表达及多克隆抗体的制备

A型塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA)是一种能引起猪特发性水疱病(Porcine idiopathic vesicular disease,PIVD)的病原体。SVA 3D蛋白主要编码RNA依赖的RNA聚合酶,与病毒的RNA复制密切相关。为制备3D蛋白的多克隆抗体,试验构建SVA 3D蛋白基因截短片段的原核表达质粒pET-32a-3D,将重组质粒转化BL21(DE3)感受态细胞,经诱导表达、纯化获得重组蛋白。用重组蛋白免疫新西兰大白兔后收集血清,获得了SVA 3D蛋白的多克隆抗体。将SVA感染BHK-21细胞,用制备的3D蛋白的抗体进行IFA和Western blot检测,结果显示,用制备的3D蛋白抗体能检测在SVA感染细胞中表达的3D蛋白,说明制备的3D蛋白多克隆抗体与3D蛋白反应性良好,为后续SVA致病机制的深入研究提供材料储备。

智慧养殖业中畜禽疾病的防治

智慧养殖业是指运用现代化电子信息技术和先进管理理念,对养殖生产全过程进行智能化管理和优化,以提高养殖效益和产品质量。在智慧养殖业中,畜禽疾病的防治是关键环节之一,其目标是实现疾病的早期预警、精准诊断和科学防治,以降低疫病风险,保障养殖业的可持续发展。畜禽疾病的防治包括:(1)畜禽疾病监测与预警:利用物联网技术和传感器设备,实时收集养殖场的环境数据和动物生理指标,通过对这些数据进行分析和挖掘,可以发现动物异常状况和潜在疾病风险。同时,结合机器学习和大数据分析技术,可以建立疾病预警模型,预测疫病的发生和发展趋势,为养殖场提供科学决策依据。(2)畜禽疾病诊断与评估:运用图像识别、机器学习等技术,对动物的行为、生理状况等进行监测和分析,可以提高疾病诊断的准确性和效率。(3)畜禽疾病防治策略:根据疾病预警和诊断结果,制定科学的防治策略,包括疫苗接种、药物治疗、隔离观察等。还可以运用智能化设备,如自动喂药器、消毒设备等,实现疫病的精准防治。(4)疫病信息管理与服务:建立疫病信息管理系统,实现疫病数据的实时采集、分析和共享,为政府部门、养殖企业、兽医机构等提供决策支持。同时,通过移动端应用、网站等渠道,为养殖户提供疫病防治知识、在线咨询等服务,提高养殖户的疫病防控意识和能力。总之,智慧养殖业中的畜禽疾病防治需要综合运用物联网、大数据、人工智能等技术,实现疾病的早期预警、精准诊断和科学防治,保障养殖业的可持续发展。

苦参碱与氧化苦参碱的常压与减压提取工艺对比研究

以水作为溶剂,在常压与减压下提取苦参碱与氧化苦参碱,对比其提取效果。以乙腈-无水乙醇-3%磷酸(体积比80∶10∶10)作为流动相,检测波长220 nm的条件下,采用高效液相色谱法,测定提取液中苦参碱与氧化苦参碱的含量。结果显示,常压法最佳提取条件为水料比8∶1,提取次数3次,每次提取时间1 h。在该工艺条件下,测得苦参总碱含量(苦参碱与氧化苦参碱的总量)、苦参碱与氧化苦参碱质量分数分别为1.19%、0.83%和0.36%。减压法最佳提取工艺的水料比、提取次数、提取时间与常压法相同,但是提取温度为70℃,最终检测苦参总碱以及各自的含量分别为1.20%、0.08%和1.12%。结果表明,两种提取工艺的苦参总碱的总质量值区别不大,但是减压法提取的氧化苦参碱含量更高,因此减压提取工艺能够有效减少毒性成分苦参碱的比例,降低苦参类药物的总体毒性,增强其推广应用价值。

冷热应激对番泻叶诱导脾虚小鼠临床症状及免疫力的影响

在连续口服番泻叶复制小鼠脾虚模型的基础上,给予小鼠冷、热刺激,探讨冷热应激对脾虚小鼠的影响。36只雄性小鼠(ICR)随机分为6组(n=6),即空白对照组(Con)、番泻叶组(S)、冷应激组(C)、番泻叶+冷应激组(SC)、冷应激+热应激组(CH)和番泻叶+热应激+冷应激组(SCH)。处理条件:S组、SC组和SCH组自由饮用番泻叶水煎液(60 g/L),Con组、C组和CH组饮用无菌水;C组和SC组每天10:00~17:00冷应激(20±2℃);CH组和SCH组每天10:00~10:30和14:00~14:30热应激(35±2℃),10:30~14:00和14:30~17:00冷应激(20±2℃);Con组和S组室温(25±2℃)饲养;冷、热应激期间禁食禁水,持续6周后,采集血液、脾、肝、肾和肠组织,进行相关检测。相较于Con组,SCH组体温、体重、采食量和脾脏指数均显著降低(P<0.01);腹泻指数显著升高(P<0.01),ALT、AST含量显著升高(P<0.01);血清中IL-6含量显著升高(P<0.01),IgG含量显著降低(P<0.05)。HE染色结果显示,SCH组脾脏组织结构模糊并有大量炎性细胞浸润;结肠组织中杯状细胞明显增加,肌层充血、水肿,有炎性细胞浸润;其他器官未见明显变化。连续6周的冷热刺激可明显加重脾虚小鼠的临床症状、结肠黏膜损伤程度,并显著降低小鼠机体免疫力,而该应激对正常小鼠无显著影响。

氧化应激与奶牛常见疾病关系研究进展

氧化应激是动物机体内氧化和抗氧化作用失衡的一种状态。剧烈的氧化应激能严重损害机体细胞DNA、蛋白质及脂质等生物大分子,抑制免疫细胞的增殖、分化和反应性,促进炎症反应,从而引发一系列疾病。越来越多的研究表明,氧化应激与奶牛酮病、脂肪肝、低钙血症、乳房炎及蹄病等多种疾病的发生发展密切相关,尤其对于围产期奶牛,由于其经历妊娠、分娩到泌乳的一系列剧烈生理变化,且普遍存在能量负平衡状态,更易发生氧化应激从而诱发系列疾病。论文就氧化应激与奶牛常见疾病关系研究进展进行综述,以期为奶牛相关疾病的综合干预提供借鉴。

绵羊NYD-SP27基因对卵母细胞体外发育的影响

为探究绵羊精子提取物NYD-SP27影响绵羊早期胚胎体外发育的分子机理,研究其是否可以作为一种新型的卵母细胞激活物质,为进一步揭示哺乳动物早期胚胎发育的分子机制提供理论基础。分别将pEGFP-N1-NYD-SP27重组质粒,pEGFP-N1显微注射到MⅡ绵羊卵母细胞中,在显微镜下观察绵羊卵母细胞体外发育的情况,统计发育率。结果显示,注射pEGFP-N1-NYD-SP27组出现卵裂情况并可继续发育到桑葚胚,然而注射pEGFP-N1组发育停滞。表明NYD-SP27基因可以促使绵羊卵母细胞在体外发育。

青海省四县牦牛牛病毒性腹泻的血清学分析

从采集的557份牦牛血清样品中,用分层抽样法选择青海省海北州祁连县和刚察县、海南州贵南县和大通县不同年龄和性别牦牛血清232份,用抗体检测试剂盒进行牛病毒性腹泻病毒(BVDV)抗体测定分析流行率,并用RT-PCR扩增BVDV基因组5′-UTR,测序进行病毒基因亚型分析。结果表明,牦牛总体BVDV真实流行率为82.30%,其中雄性牦牛BVDV真实流行率为90.01%,显著高于雌性牦牛(80.07%),且在成年牦牛2岁~3岁、3岁~4岁及4岁以上各阶段雄性牦牛BVDV流行率均显著高于雌性牦牛。5′-UTR测序结果表明,在青海牦牛至少流行4个基因亚型BVDV,包括BVDV-1a、BVDV-1m、BVDV-1q和BVDV-2a,以BVDV-1m和BVDV-1q为主导基因亚型。阐明了青海不同地区牦牛群体BVDV流行现状,为牦牛BVDV防控提供了重要依据。

猫ω干扰素和γ干扰素的可溶性原核表达及纯化

旨在克隆到猫ω干扰素和γ干扰素(FeIFN-ω和FeIFN-γ)基因的基础上,分析它们的一些生物学特性,并进行可溶性原核表达和简化纯化工艺,为后期作为抗病毒药物的开发奠定基础。根据GenBank登录的FeIFN-ω和FeIFN-γ基因序列,对其编码氨基酸的信号肽序列进行分析,设计引物用于克隆不包含信号肽的成熟蛋白基因序列,分别插入到原核表达载体pET28a-SUMO,转化入BL21感受态细胞进行表达,并通过不同的诱导时间、温度和控制IPTG浓度优化其表达条件,在纯化阶段摸索简易工艺。结果表明,FeIFN-ω基因编码区长591 bp,共编码196个氨基酸,信号肽序列为前23位氨基酸;FeIFN-γ基因编码区长504 bp,共编码167个氨基酸,信号肽序列为前20位氨基酸。将克隆到的FeIFN-ω和FeIFN-γ基因通过Bam HⅠ和Hin dⅢ酶切位点带入到含SUMO标签的原核表达载体,构建成功的重组质粒分别命名为pET28a-SUMO-FeIFN-ω和pET28a-SUMO-FeIFN-γ。优化条件后表明SUMO-FeIFN-ω融合蛋白在IPTG终浓度为0.6 mmol/L时,16℃诱导6 h表达量最高;SUMO-FeIFN-γ融合蛋白在IPTG终浓度为0.8 mmol/L时,16℃诱导9 h表达量最高。最终表达出均以可溶性形式存在的两种融合蛋白,经镍柱纯化,用SUMO蛋白酶去除标签和经两次截留柱纯化获得不含标签的干扰素,分子质量约18 ku和17 ku,与预期大小相符,表明FeIFN-ω和FeIFN-γ蛋白成功得到表达和纯化。

重组新城疫病毒载体疫苗研究进展

新城疫病毒(NDV)作为疫苗载体可以在宿主的呼吸道组织细胞中有效复制,诱导产生针对外来抗原的局部和全身免疫反应。NDV的基因组较大,可以很好地容纳外源基因。作为RNA病毒,与宿主细胞发生DNA重组的可能性较小。由于宿主范围的限制,人群中没有预先存在的NDV抗体,NDV对人类来说相对安全。因此,NDV作为一种疫苗载体颇受关注。论文简要论述了NDV的生物学特征,外源基因的插入方式,重点阐述了重组新城疫病毒载体疫苗的研究进展,以期为设计其他有效的兽用和人用活载体疫苗提供参考。

布氏锥虫Trx-putative和Trx-like的抗氧化功能研究

硫氧还蛋白(Trx)是一种氧化还原调节蛋白,参与锥虫抗宿主氧化,生物信息学分析发现Trx-putative和Trx-like含有与Trx一样的“Tioredoxin-like super family”结构域,为了阐明其抗氧化功能,通过原核表达方法获得其重组蛋白,重组蛋白免疫SD大鼠制备抗性血清,间接免疫荧光试验观察其在虫体内的表达情况,DTT/胰岛素还原法测定其二硫键异构酶活性,金属催化氧化法测定其体外保护DNA超螺旋活性,利用PCR点突变的方法分析其结构与功能的关系。结果显示,获得了纯度较高的重组蛋白,Trx-putative和Trx-like广泛分布于虫体胞质内;Trx-putative可以催化胰岛素二硫键的打开,而Trx-like不具备此功能;Trx-putative和Trx-like均可对氧化损伤的pUC19质粒产生保护,突变蛋白的二硫键异构酶活性显著降低,抗氧化作用减弱。这些结果提示布氏锥虫Trx-putative和Trx-like具有抗氧化功能。

大肠埃希氏菌噬菌体Bp38全基因组测序及生物信息学分析

为了解命名为Bp38的裂解性大肠埃希氏菌噬菌体的遗传背景及基因功能,对其进行全基因组测序和拼接,并采用EditSeq、tRNAscan-SE、tRNAdb、ORF finder、SnapGene、MEGA和Datamonkey等软件对其基因组的基本特性、功能基因预测及注释、遗传进化关系及溶菌酶基因的选择压力进行生物信息学分析。结果表明,噬菌体Bp38基因组全长170004 bp,核酸类型为dsDNA,平均G+C含量为37.60%,有140个功能基因,根据预测的功能可将其分为裂解模块、DNA包装模块、结构组成模块、假性蛋白模块和核酸复制与调控模块,有2个tRNA,分别转运精氨酸(Arg)和蛋氨酸(Met);以末端酶大亚基核酸序列构建系统进化树,分析出Bp38为有尾噬菌体目、肌尾噬菌体科、Tevenvirinae亚科、Mosigvirus属;Bp38溶菌酶基因的选择压力分析结果显示,其共有173个氨基酸位点,其中有2个正向选择位点、10个负向选择位点,分析后可知其溶菌酶基因既受外界环境选择压力的影响,又受自身进化压力的影响,且自身进化压力强于外界环境选择压力。研究结果阐明了大肠埃希氏菌噬菌体Bp38的分子特征,为进一步利用该噬菌体提供了理论依据。

犬腹主动脉瘤模型的快速建立

用弹力蛋白酶直接破坏犬腹主动脉管壁中膜的弹力板结构,快速构建一种适用于腔内治疗研究的犬腹主动脉瘤疾病模型。手术分离犬腹主动脉2 cm左右,将5 mL弹力蛋白酶(100 U/mL)注射到犬腹主动脉管壁中膜,导致犬腹主动脉管壁中膜结构和负荷失衡,不能抵抗管腔内血流压力而发生阶段性扩张。超声每天观察并记录犬腹主动脉瘤样扩张情况。血常规分析记录术后每天犬炎性细胞变化,病理组织学观察犬腹主动脉壁的组织结构、炎性细胞浸润及弹力纤维的损伤程度。结果显示,腹主动脉管壁中膜灌注蛋白酶的犬均在术后8 d形成瘤样扩张,与对照组比较差异显著(P<0.05);超声检查发现犬腹主动脉扩张存在快速扩张期(1 d~3 d)和逐渐扩张期(4 d~8 d);术后1 d~2 d各组白细胞总数显著上升、淋巴细胞数量无明显变化,术后3 d~8 d对照组各项指标均恢复至术前水平,试验组中性粒细胞数量升高,与术前差异不显著;病理组织学观察表明,主动脉管壁中膜和外膜炎性细胞浸润,弹力纤维断裂、降解,细胞外基质受损。结果表明通过此方法制作的犬腹主动脉瘤疾病模型具有成瘤时间短、操作简单、病理学特征相似和渐进性扩张的特点,适用于腔内治疗研究。

基于高通量测序技术比较雄性和雌性黑貉肠道菌群间的差异

性别不同导致肠道微生物组成和多样性存在差异,肠道微生物影响宿主的营养和免疫功能。貉是一种重要的经济动物,但是不同性别貉的肠道微生物的差异尚未见报道。通过比较冬毛期雌貉与雄貉肠道微生物的差异,探究性别对冬毛期貉肠道微生物的影响。试验于2月份,在同一饲养场采集了24只(雌雄各半)日粮及年龄相同、健康的冬毛期黑貉的新鲜粪便,基于Illumina Miseq平台进行16S扩增子测序。结果表明,雌貉肠道菌群的观测物种数显著高于雄貉,Shannon指数和ACE指数虽然高于雄貉,但是差异并不显著;在门水平上,雌貉和雄貉粪便均以厚壁菌门、拟杆菌门和变形菌门为主,各菌门在组间均无显著差异。在属水平上,Streptococcus、Bacteroides、Phascolarctobacterium、Lactobacillu、Blautia和Alloprevotella等在雌貉与雄貉粪便菌群中均占优势地位。各菌属在组间均无显著差异;雌貉与雄貉肠道菌群的群落结构差异不显著;功能预测发现,碳水化合物代谢、脂质代谢和能量代谢等功能在性别间存在显著差异。因此,冬毛期雌貉与雄貉的肠道微生物间存在差异。

新城疫病毒LaSota株检测用国家核酸标准物质的研制

为满足禽类及禽类产品质量安全检测领域对标准物质的需求,将新城疫病毒(NDV)LaSota株接种于9日龄SPF鸡胚,72 h后收集鸡胚尿囊液,经灭活后分装、冻干,制备新城疫病毒LaSota株核酸标准物质。对该标准物质开展了均匀性评估、稳定性评估、标准物质定值、不确定度评定和临床适用性评价。结果表明,该标准物质均匀性、稳定性良好,4℃环境下可稳定4周,在-20℃环境下可稳定保存11个月,经8家实验室合作定值和不确定评定,其定值结果为1.7×10^(5)copies/mg±0.3×10^(5)copies/mg。经3家临床试用单位试用证实,其量值的准确度高,与临床样本互通性好。