猪繁殖与呼吸综合征病毒促进猪链球菌2型感染猪肺泡巨噬细胞的初步研究

为探究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)对不同毒力猪链球菌2型(SS2)感染巨噬细胞的影响,本研究建立了高致病性PRRSV Li11株和SS2强毒株HA或无毒菌株T1/5共感染永生化猪肺泡巨噬细胞(iPAM)的模型,实验分为4组:HA单独感染组(HA组)、PRRSV-HA共感染组(PRRSV-HA组)、T1/5单独感染组(T1/5组)和PRRSV-T1/5共感染组(PRRSV-T1/5组),利用该模型通过黏附试验、侵入试验和细胞内存活试验检测PRRSV对HA和T1/5黏附、侵入iPAM细胞及对该细胞存活率的影响,进一步利用荧光定量PCR方法检测各感染组iPAM模型细胞中细胞因子(TNF-α、IL-6、IL-8、IFN-β)的转录水平。黏附试验结果显示,HA感染2 h后,PRRSV-HA组细菌对细胞的黏附水平极显著高于HA组(P<0.01或P<0.001);T1/5感染6 h后,PRRSV-T1/5组细菌对细胞的黏附水平极显著高于T1/5组(P<0.001),表明PRRSV与HA或T1/5共感染可以促进HA和T1/5对iPAM模型细胞的黏附,且HA对iPAM细胞的黏附水平高于T1/5。侵入试验结果显示,感染4 h后,共感染组细菌侵入iPAM细胞中的数量比单独感染组极显著增多(P<0.01或P<0.001)。细胞内存活试验结果显示,感染2 h后,共感染组细菌的存活率比单独感染组极显著升高(P<0.001)。荧光定量PCR试验结果显示,感染4 h时,共感染组iPAM细胞中细胞因子(TNF-α、IL-6、IL-8、IFN-β)的转录水平极显著高于单独感染组(P<0.001)。本研究首次建立了高致病性PRRSV Li11株和SS2强毒株HA或无毒菌株T1/5共感染i PAM的模型,基于该模型研究首次发现PRRSV感染不仅促进了不同毒力SS2对i PAM细胞的黏附、侵入及SS2在iPAM细胞内的存活,还可以协同SS2显著提高该细胞中细胞因子的转录水平。本研究为进一步探究PRRSV和SS混合感染的机制提供了参考依据。

基于转录组学分析自然感染绵羊肺腺瘤病毒患羊肺肿瘤组织中转录差异基因及病毒致瘤机制的研究

绵羊肺腺瘤病(OPA)是由绵羊肺腺瘤病毒(JSRV)引起的绵羊传染性肺肿瘤疾病。为探究JSRV对绵羊肺脏的致瘤机制,本研究从自然感染JSRV的羊(OPA患羊)肺肿瘤组织和健康羊肺组织中提取总RNA,构建二者的cDNA文库后采用Illumina Hi Seq 4000高通量测序平台进行转录组学测序(RNA-Seq),采用DESeqR筛选健康绵羊与患病绵羊肺组织中的转录差异基因,并以P<0.05和log2(Fold change)≥1筛选转录显著差异基因。通过GO和KEGG数据库对转录显著差异基因进行GO功能和KEGG信号通路的富集分析,并采用RT-qPCR对随机选择的10个转录显著差异基因进行验证。结果显示,与对照组相比,OPA羊肺肿瘤组织中共筛选到1 360个转录上调基因和783个转录下调基因,其中154个转录显著上调基因,212个转录显著下调基因。GO功能分析显示,转录显著差异基因显著富集在178个GO条目中,包括114个生物过程(BP)、19个细胞成分(CC)和45个分子功能(MF),主要涉及生长因子活性、复制后修复、NAD^(+)二磷酸酶活性、核苷代谢过程和鸟苷核苷酸交换因子活性等生物学功能。KEGG分析显示转录显著差异基因主要富集在细胞增殖、分化和肿瘤生成,如PI3K/Akt、MAPK和Hippo等信号通路。RT-qPCR结果显示,10个转录显著差异基因与RNA-Seq筛选结果均一致。本研究进一步通过RT-qPCR、western blot检测Hippo信号通路核心蛋白哺乳动物STE20样蛋白激酶1/2 (MST1/2)、大肿瘤抑制因子1/2 (LATS1/2)、YES相关蛋白1/2 (YAP1)在两组绵羊肺组织样品中的转录及表达水平和YAP1的磷酸化水平(p-YAP1);采用免疫组化试验(IHC)检测Hippo信号通路中上述核心蛋白在两组绵羊肺组织中的表达及定位。RT-qPCR结果显示,与对照组相比,OPA羊肺组织中MST1和YAP1 mRNA的转录水平均极显著上调(P<0.01、P<0.001),LATS1 mRNA的转录水平显著上调(P<0.05)。Western blot结果显示,MST1/2蛋白在59 ku、YAP1和p-YAP1蛋白在65 ku、LATS1/2蛋白在140 ku处分别出现特异性条带;与对照组相比,OPA绵羊肺肿瘤组织中MST1/2和p-YAP1的表达水平显著上调(P<0.05),LATS1/2和YAP1的表达水平极显著上调(P<0.01)。IHC结果显示,在OPA组和对照组羊肺组织中MST1/2、LATS1/2及p-YAP1均定位于肺组织细胞质中,且与对照组相比,OPA组羊肺组织中上述分子均呈强阳性表达。YAP1主要定位于对照组羊肺组织细胞的胞质中,而在OPA组中YAP1主要定位于细胞核中(少量定位于细胞质中)。上述结果表明,OPA组绵羊肺组织中存在转录显著差异基因,主要参与细胞增殖、肿瘤发生和转移等过程,且主要富集在PI3K/Akt、MAPK、Hippo等信号通路,尤其是Hippo信号通路中的YAP蛋白可能通过核异位促进肿瘤的发生与发展。本研究为JSRV致瘤机制提供了新的研究基础与研究思路和方向。

茜草素对APP/PS1双转基因小鼠肠道菌群的干预作用及机制研究

为研究茜草素(AZ)对APP/PS1双转基因小鼠(APP/PS1小鼠)肠道菌群、学习与记忆能力的影响,本实验将APP/PS1小鼠分为模型组(APP/PS1组)、AZ组[低剂量(Low)、中等剂量(Middle)、高剂量(High)]、阳性对照组[盐酸多奈哌齐(Donepezil组)],以APP/PS1阴性小鼠为空白对照组(Control组)。AZ组小鼠连续给药AZ 4周后,利用Morris水迷宫检测各组小鼠的学习与记忆能力;利用16S rRNA基因测序检测各组小鼠粪便肠样品中道菌群的变化。结果显示,与Control组小鼠相比,APP/PS1组小鼠逃避潜伏期显著延长(P<0.05)、穿越平台次数和象限停留时间极显著或显著减少(P<0.01、P<0.05),本实验选择AZ中剂量组(20 mg/kg AZ)进行后续试验;模型组小鼠肠道菌群多样性明显改变、菌落组成差异明显。给予AZ干预后,小鼠逃避潜伏期显著缩短(P<0.05)、穿越平台次数和象限停留时间均显著增加(P<0.05);AZ能有效提高APP/PS1小鼠肠道菌群多样性及改变肠道微生物结构,在门水平上,AZ能提高小鼠肠道厚壁菌门丰度,降低拟杆菌门相对丰度;在科水平上,AZ增加了小鼠肠道Muribaculaceae和Lachnospiraceae细菌的相对丰度,降低了Prevotellaceae、norank_o__Clostridia_UCG-014、Ruminococcaceae等菌群丰度;在属水平上,AZ明显提高了小鼠肠道Lactobacillus的相对丰度,进一步筛选出AZ组小鼠肠道优势菌种为o__Lactobacillales、f__Lactobacillaceae、g__Lactobacillus。通过PICRUSt2功能预测分析发现,AZ调节小鼠肠道菌群功能与炎症相关信号通路有关。本研究首次证实AZ可通过调节肠道菌群改善APP/PS1小鼠的学习及记忆能力,其机制与炎症信号通路有关,为AZ的临床应用奠定基础。

Ⅱd亚型微小隐孢子虫感染昆明小鼠模型的初步建立

为建立稳定、可靠的Ⅱd亚型微小隐孢子虫感染的小鼠模型,本研究以1×10^(6)个/只剂量的Ⅱd亚型微小隐孢子虫卵囊感染3周龄雌性昆明小鼠,对感染前后小鼠粪便样品进行显微镜观察和隐孢子18S r RNA和GP60基因的套式PCR检测、以及对小鼠的排卵囊规律、临床症状变化、体质量变化、回肠组织病变特征和回肠绒毛指数进行分析。结果显示:通过形态学和PCR方法均能在粪便样品中检测到微小隐孢子虫;感染组小鼠较对照组在排卵囊高峰期体质量的增加略微减少,但总体增加趋势一致,在排卵囊高峰期时感染组小鼠饮水量减少、反应迟钝、粪便变稀,高峰期后小鼠精神状态逐渐恢复良好;通过对感染后7 d小鼠的回肠组织制备病理切片并经HE染色后观察发现,与对照组相比,感染组小鼠回肠组织中出现微小隐孢子虫附着,部分区域杯状细胞数量减少,上皮细胞排列轻微紊乱且部分脱落,黏膜层可见少量炎症细胞;回肠绒毛长度显著变短、变钝,隐窝深度变浅,但绒毛直径和黏膜厚度未见显著变化。上述结果与动物临床感染隐孢子虫的症状、病理变化等基本一致,表明本研究首次建立了Ⅱd亚型微小隐孢子虫感染昆明小鼠的模型。本研究该模型的建立为研究微小隐孢子虫的致病性、宿主的免疫调节机制以及药物和疫苗的筛选提供研究基础。

曼氏杆菌(Mannheimia pernigra)的分离鉴定及基因组序列分析

为了对云南3起奶牛和山羊呼吸道疾病进行病原检测,本研究在5%CO_(2)的培养条件下从呼吸道疾病奶牛和山羊的肺脏中分离到3株革兰阴性嗜二氧化碳小杆菌YN21118、YN22011和ZY171111,对3株分离株进行16S r DNA基因的PCR扩增及同源性和遗传进化分析,结果显示3株分离株与曼氏杆菌(Mannheimia pernigra)模式菌株CCUG 74657T及其它M.pernigra分离株的16S r DNA基因序列的同源性达99.6%以上,且3株分离株与M.pernigra参考株形成同一个进化分支,表明3株分离株均为M.pernigra。采用琼脂扩散法检测3株分离株对10类32种抗菌药物的敏感性,结果显示3株分离株对青霉素类的阿莫西林克拉维酸、头孢菌素类的头孢噻吩、喹诺酮类的氧氟沙星等29种抗菌药物敏感。将3株分离株感染小鼠进行致病性试验,结果显示3株分离株均能引起小鼠呼吸道疾病。采用Illumina Miseq和PacBio高通量测序平台对分离株ZY171111进行全基因组高通量测序并预测其毒力基因和耐药基因,基因组序列分析结果显示,分离株ZY171111基因组全长2 197 384 bp,G+C摩尔含量为39.1%,基因组携带1 978个蛋白编码基因,其中包括溶血素基因hlyB、黏附相关基因htpB、生存胁迫相关基因clpP和katA等32个毒力基因和磺胺类耐药基因folP、氨基糖苷类耐药基因StrA、喹诺酮类耐药基因gyr A和parC、甲氧苄啶耐药基因dfr A3等39个耐药相关基因。本研究在我国首次分离到M.pernigra,证实我国存在奶牛和山羊M.pernigra感染,并于国内外首次报道M.pernigra的耐药性、耐药基因及其对小鼠的致病性,上述结果为深入研究M.pernigra的致病性和耐药性提供菌种资源和基因组数据。

宿主因子KRT2影响A型流感病毒复制的研究

本实验室前期通过质谱分析筛选到宿主因子II型角蛋白2(KRT2),推测其可能与流感病毒复制相关。为进一步研究KRT2对流感病毒复制的影响,本研究将真核表达质粒pCAGGS-KRT2-Myc转染至HEK293T细胞24 h后,感染A/WSN/1933(H1N1)株病毒,采用噬斑滴定、western blot及激光共聚焦技术检测过表达KTR2蛋白对流感病毒复制影响,结果显示,过表达KRT2蛋白后流感病毒滴度和NP蛋白表达均下降;激光共聚焦试验检测结果显示,过表达KRT2蛋白后,流感病毒复制早期NP蛋白向细胞核内的聚积受到了抑制。针对KRT2基因设计特异性siRNA-1/2,转染A549细胞后采用细胞活力检测试剂盒检测下调KRT2蛋白表达后对A549细胞活力影响,进一步利用荧光定量PCR方法检测干扰效率,筛选最佳siRNA,结果显示,与对照siRNA相比,KRT2特异性siRNA处理不影响A549细胞活力,且siRNA-2能更有效降低KRT2的表达。以A/WSN/1933(H1N1)株病毒感染siRNA-2转染后的A549细胞,采用噬斑滴定、western blot及激光共聚焦技术检测siRNA-2干扰下调KTR2蛋白表达对流感病毒复制影响,上述试验结果均显示,KRT2表达下调后病毒滴度和NP蛋白表达均显著提高;激光共聚焦试验结果显示,下调KRT2蛋白表达后,流感病毒在复制早期阶段受到了抑制。本研究结果首次表明,KRT2是一种负调控流感病毒复制的宿主因子。本研究丰富了流感病毒与宿主因子互作的网络,也深化了对宿主因子影响流感病毒复制机制的认知。

《中国预防兽医学报》编辑部

《中国预防普医学报》是由中华人民共和国农业农村部主管,中国农业科学院哈尔滨兽医研究所主办的国家级学术类期刊,面向国内外公开发行。《中国预防普医学报》为我国预防曾医科技领域学术交流的平台。本刊自1979年创刊以来影响力不断扩大,先后成为中文核心期刊、中国自然科学核心期刊、中国农业核心期刊、国内的各大数据库收录及来源期刊。

犬圆环病毒荧光RAA检测方法的建立及初步应用

为建立一种高效、简便的犬圆环病毒(CCV)的检测方法,本研究针对CCV Rep基因设计了特异性引物和探针,同时构建了基于该病毒Rep基因的重组质粒标准品pCCV-Rep,经过优化后确定了CCV重组酶介导核酸等温扩增(RAA)检测方法引物、探针的最适浓度均为10μmol/L,在39℃恒温条件下20 min即可完成检测。利用该方法检测犬圆环病毒、狂犬病病毒、犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬副流感病毒、犬腺病毒等其他常见的犬源病毒,结果显示除CCV外,该方法对其他病毒均无交叉反应,特异性较强;将p CCV-Rep分别稀释为10~6拷贝/μL~10~0拷贝/μL后作为模板,进行敏感性试验,结果显示该方法最低检出限可达10~2拷贝/μL,敏感性较高;批内批间重复性试验结果均表明该方法具有良好的重复性。采用该方法与常规PCR方法同时检测82份犬粪便拭子,结果显示,该RAA方法检出阳性样品5份,检测结果与常规PCR一致。本实验首次建立的CCV荧光RAA检测方法简便、高效、特异、灵敏,为CCV的临床筛查与流行病学研究提供了可行技术。

甘草酸通过HMGB1/TLR4/JNK信号通路抗猪急性腹泻综合症冠状病毒感染的研究

猪急性腹泻综合症冠状病毒(SADS-CoV)是一种新发现的肠道冠状病毒,引起仔猪严重的临床腹泻和肠道病理损害。为探究甘草提取物的主要成分甘草酸(GLY)抑制SADS-CoV复制的机制,本研究利用不同浓度的GLY对非洲绿猴肾细胞(Vero E6)和猪回肠上皮细胞(IPI-2I)预处理2 h并感染不同浓度的SADS-CoV后,分别经western blot和TCID_(50)检测,结果显示N蛋白的表达量显著减少且病毒滴度下降,表明GLY在体外能够抑制SADS-CoV的感染。利用不同浓度GLY对Vero E6和IPI-2I细胞预处理2 h后,感染灭活的SADS-CoV,western blot结果显示在GLY浓度为0.8 mmol/L时,N蛋白表达量显著减少,表明GLY能够抑制该病毒的侵入。选取0.4 mmol/L GLY处理细胞,再感染SADS-CoV后2 h、6 h、12 h收取细胞样品经western blot检测,结果显示各时间点N蛋白表达量均显著减少,表明GLY对该病毒的复制抑制效果显著。GLY是高迁移率族蛋白B1(HMGB1)的竞争性抑制剂,而HMGB1的受体主要有TLR4和RAGE,因此构建了HMGB1关键性位点(C^(45)S、C^(106)S、C^(45/106)S)突变的质粒和RAGE受体的siRNA,分别转染Vero E6细胞并感染SADS-CoV,收获上清液和细胞样品,利用western blot和TCID_(50)检测。结果显示,N蛋白表达量显著减少且病毒滴度下降,表明GLY在SADS-CoV感染时通过影响HMGB1与TLR4和RAGE的结合而发挥功能。为了进一步探究GLY发挥作用的信号通路,分别将SADS-CoV感染Vero E6和IPI-2I细胞,收获细胞样品,利用western blot检测MAPK信号通路相关蛋白的变化,结果显示p-p38、p-JNK、p-ERK表达量在感染早期和晚期上调,表明SADS-CoV感染激活了MAPK通路。利用不同浓度的GLY和TLR4抑制剂TAK对Vero E6和IPI-2I细胞预处理2 h后感染SADS-CoV,收获蛋白样品,western blot结果显示p-JNK和N蛋白表达量显著减少,其他蛋白无明显变化,表明GLY和TAK调控JNK的磷酸化,而不能调控p38和ERK的磷酸化。利用HMGB1中和抗体预处理Vero E6细胞、将HMGB1的siRNA以及构建的HMGB1关键位点突变的真核表达质粒分别转染Vero E6细胞后感染SADS-CoV,收获上述细胞样品,western blot结果显示p-JNK的表达量均减少,表明HMGB1影响了JNK的磷酸化;利用不同浓度的JNK抑制剂SP600125对Vero E6和IPI-2I预处理2 h,再感染SADS-CoV,利用western blot、TCID_(50)和IFA检测,结果显示N蛋白表达量及病毒滴度均下降且病毒复制减少,表明SP600125抑制了病毒的复制。综上所述,本研究首次证实GLY主要通过HMGB1/TLR4/JNK信号通路抑制SADS-CoV的体外复制,该通路的发现为研究抗SADS-CoV的新型药物提供了数据支持。

非洲猪瘟病毒H240R蛋白拮抗宿主炎症反应信号通路的活化及其作用机制

非洲猪瘟(ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)感染引起猪的一种以发热和广泛出血为特征的高度致死性传染病,是养猪业的“头号杀手”。ASFV为一种大的双链DNA病毒,病毒粒子直径为260 nm~300 nm,病毒基因组为170 kb~194 kb,编码超过160种蛋白。ASFV感染的靶细胞主要是巨噬细胞。研究表明,ASFV感染猪巨噬细胞可诱导低水平促炎性细胞因子的表达,然而其分子机制尚不清楚。

非洲猪瘟病毒MGF110-9L和MGF505-7R双基因缺失株(ASFV-Δ9L/Δ7R)具有良好免疫保护效果

非洲猪瘟(ASF)是由ASF病毒(ASFV)感染引起的家猪和野猪的急性接触性传染病,强毒株感染致死率可达100%。ASF是世界动物卫生组织(WOAH)规定必须报告的动物传染病之一,也是我国规定的Ⅰ类传染病。2018年我国沈阳首次暴发ASF疫情,随着传播范围的扩大,我国的养猪业受到了沉重打击。该病首次于1921年在非洲肯尼亚发现,目前无商品化疫苗,急需研制安全、有效和质量可控的疫苗,基因缺失疫苗即是是其一。

布鲁氏菌BspG基因缺失对其部分生物学活性影响的研究

为探究布鲁氏菌BspG基因在布鲁氏菌胞内循环感染中的作用,本研究利用PCR方法扩增流产布鲁氏菌(Brucella abortus)2308株BspG基因上、下游同源臂及卡那基因片段,利用融合PCR将上述3个基因片段融合后克隆至pMD19-T载体中构建重组质粒pMD19-BspG-Kan;同时从B. abortus 2308株中扩增BspG基因并克隆至pBBR1MCS-4载体中,构建重组质粒pBBR1MCS-4-BspG。上述两种质粒均经PCR及测序鉴定。将pMD19-BspGKan电转化至B. abortus 2308株中,24 h后利用Kan筛选BspG基因缺失株(ΔBspG),并经PCR鉴定;将pBBR1MCS-4-BspG转化ΔBspG菌株,经Kan+、AMP+抗性平板筛选BspG基因回补株(pBspG),并经PCR及测序鉴定。将上述两株菌连续传15代后分别利用PCR方法鉴定其的遗传稳定性;通过检测不同培养时间点的OD600nm值并绘制生长曲线分析上述两株菌与亲本菌株的生长特性;按照MOI 100将ΔBspG、pBspG和亲本株分别感染RAW 264.7细胞后不同时间,通过检测细胞内的细菌数量分析各菌株的粘附与侵袭能力(感染后15 min、30 min、45 min、60 min)和胞内生存能力(感染后4 h、8 h、12 h、24 h、48 h)。PCR鉴定结果显示,分别获得了基因缺失株ΔBspG和回补株pBspG且这两株菌分别传至15代后均未出现回复突变现象,表明ΔBspG和pBspG的遗传稳定性均较强;生长曲线结果显示,ΔBspG和pBspG的体外生长趋势明显慢于亲本株;粘附与侵袭力试验结果显示,侵染巨噬细胞1 h内,ΔBspG和pBspG的胞内存活数均与亲本株无显著差异,表明敲除Bsp G不影响细菌的粘附与侵袭能力;侵染巨噬细胞24 h内,ΔBsp G与亲本株的胞内活菌数无显著差异(P>0.05),而24 h后ΔBsp G的胞内活菌数极显著低于亲本株(P<0.01)。本研究结果首次表明BspG基因缺失降低了布鲁氏菌的胞内增殖能力,为研究BspG基因在布鲁氏菌致病机理中的作用奠定基础。

H5N8亚型禽流感病毒肆虐全球,为什么中国家禽“独善其身”?

2020年以来,H5N8亚型禽流感病毒(以下简称H5N8病毒)肆虐全球,在20多个国家引发近2 800起家禽和野鸟疫情,导致3 300多万只家禽死亡或被扑杀,给全球的家禽养殖业造成巨大经济损失。其中,处于野鸟迁徙路线的韩国和日本因疫情而扑杀的家禽分别为1 100多万和900多万只,成为东南亚H5N8禽流感疫情的重灾区。中国比邻韩日,也是野鸟迁徙路线的途经国,而全球数量最多的中国家禽却能"独善其身"。

氨基肽酶N(APN)促进猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)侵入细胞的分子机制

猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)是一种新型猪肠道冠状病毒,是尼多目、冠状病毒科、冠状病毒亚科、δ冠状病毒属成员,为有囊膜的单股正链RNA病毒。2012年首次在香港发现该病毒,可致哺乳仔猪腹泻和呕吐,迅速脱水,严重时会致猪死亡。

弓形虫SNARE家族蛋白在囊泡分泌系统中的关键作用

囊泡运输是真核细胞内物质运输的基本形式,主要发生在细胞质膜及不同细胞器之间,其基本过程包括出芽、定向转运、栓留和膜融合等。刚地弓形虫为顶复门原虫的模式生物,包含许多独特型细胞器如顶质体、微腺体、棒状体,致密颗粒等。这些细胞器的分泌蛋白在虫体入侵宿主细胞和维持自身生存方面发挥重要作用。顶质体起源于藻类,通过双重内共生进入顶复门生物细胞内。弓形虫顶质体相关蛋白参与虫体多种必需物质(二型脂肪酸和类异戊二烯)的代谢合成,对虫体的生存发挥重要作用。

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国际标准大16开本110页定价每期15.00元全年180.00元邮发代号:14—70《中国预防兽医学报》是由中华人民共和国农业农村部主管,中国农业科学院哈尔滨兽医研究所主办的预防兽医科技专业期刊,面向国内外公开发行。创刊40年来影响力不断扩大,先后成为中文核心期刊、中国自然科学核心期刊、中国科技核心期刊、中国农业核心期刊、国内各大数据库收录及来源期刊,以及美国化学文摘数据库(CA)、英国国际农业与生物科学研究中心数据库(CABI)、波兰哥白尼索引来源及收录期刊等。本刊的影响因子历年来均位居全国动物医学类核心期刊前列,多次被评为全国农业优秀期刊、全国畜牧兽医科技优秀期刊和《CAJ-CD》执行优秀期刊。

新疆规模化牛场温氏支原体(附红细胞体)的调查

为了解新疆两个规模化牛场温氏支原体(附红细胞体)的流行情况,本研究采集了不同年龄段牛(<6月龄犊牛、后备母牛、成年母牛、育肥牛)的血液样品共152份,利用PCR方法扩增血液样品中的温氏支原体16S rRNA部分基因序列,两个牛场各选取3份PCR产物测序后分析其与温氏支原体参考株(AF016546)的同源性并统计温氏支原体的感染情况;采用Mega7.0软件对扩增出的16S rRNA部分基因与Genbank数据库里登录的温氏支原体分离株相应基因序列构建进化树分析其遗传进化关系;利用相关性检验分析牛特征性临床症状与温氏支原体阳性检出率的相关性。结果显示,152份血液样品中有59份样品扩增出约750 bp的目的基因片段。测序分析结果显示本研究获得的16S rRNA基因序列与温氏支原体分离株FJ375309.1、MG948625.1的16S rRNA基因序列同源性达100%,与温氏支原体参考株(AF016546)同源性达99.16%。结果表明,59份血液样品检测到温氏支原体,阳性检出率为38.82%(59/152),A场阳性检出率为65.0%(52/80),B场阳性检出率为9.7%(7/72)。不同年龄段牛的阳性检出率分别为:成年母牛(13.82%,21/152)>后备母牛(13.15%,20/152)>育肥牛(7.89%,12/152)>犊牛(3.95%,6/152)。系统发育树显示,本研究所测的16S rRNA基因序列与温氏支原体中国丰都分离株(FJ375309.1)亲缘关系最近。相关性检测结果显示,温氏支原体阳性检出者与其临床症状(主要是消瘦、贫血)呈弱相关性。阳性检出率较高的成年母牛和后备母牛为温氏支原体在规模化养殖场的持续流行提供了传染源。本研究证实了温氏支原体在新疆规模化牛场的流行。

牛源副猪链球菌的分离鉴定及生物学特性分析

为了对两起牛呼吸道疾病病原进行细菌学诊断,本研究分别从出血性肺炎病死牛的肺脏和流涎病牛的唾液中分离到2株革兰氏阳性链状球菌YN180721和ZY200425。生理生化试验结果显示2株分离株生化特征与副猪链球菌(Streptococcus parasuis)模式菌株JCM 30273T相符;通过对16S rDNA基因扩增测序、分析结果显示,2株分离株与19株S.parasuis参考株形成第一个进化分支,全部13株猪链球菌(Streptococcus suis)参考株形成第二个进化分支;16S rDNA基因同源性分析结果显示,2分离株与S.parasuis参考株之间的同源性为98.8%~100%,与JCM 30273T株之间的同源性分别为98.9%和100%。以上结果表明2株分离株均为S.parasuis。进一步对16S rDNA基因分析结果显示,2株分离株和S.parasuis参考株存在两个独特相邻的核苷酸插入片段ATGA和CATT,这两个核苷酸插入片段可作为鉴别S.parasuis和S.suis的遗传标记。药敏试验结果显示,2株分离菌株对青霉素、阿莫西林、头孢噻吩等多种抗生物敏感,对磺胺甲恶唑耐药。将两株分离菌悬液分别以1×10^(8)cfu/只腹腔接种小鼠,进行致病性试验,结果显示,2株分离株对小鼠均具有较强致病性。本研究在国内首次分离到牛源S.parasuis,证实牛S.parasuis感染在我国的存在,对了解S.parasuis的生物学特性和牛S.parasuis感染的预防和控制具有重要指导意义。

NADC30-like谱系猪繁殖与呼吸综合征病毒荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为定量检测NADC30-like谱系猪繁殖与呼吸综合征病毒(NADC30-like PRRSV),本研究针对NADC30 PRRSV株的ORF6基因保守区域设计1对特异性引物,通过优化反应条件,建立了一种灵敏度高、耗时短、操作简便且可量化的SYBR Green I荧光定量PCR检测方法。建立的标准曲线结果显示:Ct值与质粒标准品浓度之间存在良好的线性关系,相关系数(R~2)为0.995。该方法特异性强,除对NADC30-like PRRSV有特异性扩增外,对猪圆环病毒2型(PCV2)、猪塞尼卡病毒(SVA)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、猪细小病毒(PPV)、经典型猪繁殖与呼吸综合征病毒(C-PRRSV)和NADC34-like PRRSV等病原均无扩增。对质粒标准品的检测下限可达4.62×10~1拷贝/μL,敏感性为常规PCR方法的100倍。组内变异系数与组间变异系数均小于1%,重复性较好。利用该方法与常规PCR方法同时检测53份血清样品,该方法的阳性检出率为11.3%(6/53),高于普通PCR的阳性检出率(9.4%,5/53),二者的总符合率为89.11%。本研究建立的SYBR Green I荧光定量PCR方法可以用于NADC30-like PRRSV的快速检测,为PRRS的防控提供技术支持。

一株黑叶猴源鸟肠球菌的分离鉴定及耐药分析

黑叶猴是我国一级重点保护动物,2018年11月贵州某动物园中黑叶猴出现死亡,为调查其原因,本研究采集病死黑叶猴的肺脏样品进行细菌分离纯化,并对分离菌进行革兰氏染色镜检、生化鉴定、16S rRNA基因序列鉴定、小鼠致病性试验及分离株的药敏试验和耐药基因检测。结果显示:经形态观察、培养特性鉴定以及16S r RNA的PCR鉴定,该分离株为鸟肠球菌,将其命名为GZ1811;16S rRNA基因的同源性分析及进化树结果显示,GZ1811株与GenBank中鸟肠球菌的一致性为100%;小鼠致病性试验结果显示,小鼠出现临床症状,甚至死亡,解剖可见其肺脏有散在出血点;药敏试验结果显示,分离株对四环素等药物耐药。耐药基因PCR检测结果显示分离菌株的四环素类耐药基因tetM呈阳性,表明耐药表型和耐药基因型一致。本实验为黑叶猴鸟肠球菌病的诊断和防治提供具有科学价值的参考依据。